Анализ лигирования методом близости

Рис. 1 : PLA начинается со связывания антител разных видов с 2 представляющими интерес белками, в данном случае с белком * (звездочка) и белком №

Анализ близости лигирования (in situ PLA ) - это технология, которая расширяет возможности традиционных иммуноанализов, включая прямое обнаружение белков, белков. взаимодействия и посттрансляционные модификации с высокой специфичностью и чувствительностью. Белковые мишени могут быть легко обнаружены и локализованы с разрешением отдельных молекул и объективно количественно определены в немодифицированных клетках и тканях. Используя только несколько клеток, субклеточные события, даже временные или слабые взаимодействия, выявляются in situ, и субпопуляции клеток могут быть дифференцированы. В течение нескольких часов могут быть подтверждены результаты обычных методов совместной иммунопреципитации и совместной локализации.

• 1 Принцип PLA
• 2 Приложения
• 3 Ссылки

Рисунок 2 : Связывание зондов PLA.

Два первичных антитела, индуцированные у разных видов, распознают целевой антиген на интересующих белках (Рисунок 1). Вторичные антитела (2 Ab), направленные против константных областей различных первичных антител, называемые зондами PLA, связываются с первичными антителами (рисунок 2).

Рисунок 3 : синтез ДНК по катящемуся кругу

Каждый из зондов PLA имеет прикрепленную к нему короткую последовательность, специфичную цепь ДНК. Если зонды PLA находятся в непосредственной близости (то есть, если два исходных интересующих белка находятся в непосредственной близости или являются частью белкового комплекса, как показано на рисунках), нити ДНК могут участвовать в катящемся круге Синтез ДНК при добавлении двух других последовательностей ДНК-олигонуклеотидов вместе с соответствующими субстратами и ферментами (рис. 3).

Фиг.4 : Флуоресцентные зонды связываются с амплифицированной ДНК.

Реакция синтеза ДНК приводит к многократной амплификации круга ДНК. Затем добавляются комплементарные олигонуклеотидные зонды с флуоресцентной меткой, и они связываются с амплифицированной ДНК (рис. 4). Результирующая высокая концентрация флуоресценции легко видна как отчетливое яркое пятно при просмотре с помощью флуоресцентного микроскопа. В показанном конкретном случае (рис. 5) ядро ​​ увеличено, потому что это В-клеточная лимфома клетка. Два представляющих интерес белка - это В-клеточный рецептор и MYD88. Обнаружение взаимодействия в цитоплазме было интересным, поскольку считается, что рецепторы В-клеток расположены в клеточной мембране.

Рисунок 5 : Изображение флуоресцентной микроскопии, показывающее взаимодействие белков в цитоплазме. Ядро выделено синим цветом, продукт PLA - красным.

PLA, как описано выше, использовался для изучения аспектов развития животных и рака груди среди многих других темы. Вариант метода (rISH-PLA) был использован для изучения ассоциации белка и РНК. Другой вариант in situ PLA включает в себя мультиплексный анализ PLA, который позволяет визуализировать несколько белковых комплексов параллельно. PLA также можно комбинировать с другими формами считывания, такими как ELISA, проточная цитометрия. и Вестерн-блоттинг