Бактериальный дисплей

Бактериальный дисплей (или отображение бактерий или отображение поверхности бактерий ) - это метод белковой инженерии, используемый для in vitro эволюции белка. Библиотеки полипептидов, отображаемые на поверхности бактерий, могут быть проверены с помощью проточной цитометрии или процедур итеративного отбора (биопэннинг). Этот метод белковой инженерии позволяет нам связать функцию белка с геном, который его кодирует. Бактериальный дисплей может использоваться для поиска белков-мишеней с желаемыми свойствами и может использоваться для получения аффинных лигандов, которые являются клеточно-специфическими. Эта система может использоваться во многих приложениях, включая создание новых вакцин, идентификацию ферментных субстратов и определение сродства лиганда к его белку-мишени.

Отображение бактерий часто сочетается с методами сортировки клеток с магнитной активацией (MACS) или сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). Конкурирующими методами эволюции белка in vitro являются фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей и дисплей мРНК. Отображение бактериофагов является наиболее распространенным типом используемых систем отображения, хотя отображение бактерий становится все более популярным по мере преодоления технических проблем. Бактериальный дисплей в сочетании с FACS также имеет то преимущество, что это метод в реальном времени.

• 1 История
• 2 Принцип
  • 2.1 Каркас
• 3 Применения
  • 3.1 Скрининг на основе аффинности
  • 3.2 Картирование эпитопа антител
  • 3.3 Идентификация пептидных субстратов
  • 3.4 Идентификация клеточно-связывающих пептидов
  • 3.5 Доставка вакцины
• 4 Сравнение с фаговым дисплеем
• 5 Ссылки

Системы клеточного дисплея были впервые использованы в 1985 году, когда пептиды были генетически слиты с белками, отображаемыми на бактериофаге M13. Отображение бактериофагов - это широко используемая система отображения клеток, хотя она имеет ограничения по размеру отображаемых белков. Затем в 1986 году был введен бактериальный дисплей, позволяющий отображать на поверхности более крупные белки. Системы бактериального дисплея были впервые представлены Freudl et al. и Charbit et al. в 1986 году, когда они использовали бактериальные поверхностные белки OmpA и LamB для отображения пептидов. Freudl et al. слитые пептиды с линкерами с геном ompA, в результате чего пептиды экспрессируются в белках OmpA. Они показали, что белки теперь подвергаются расщеплению протеиназой К. Таким образом, вставленные пептиды, не являющиеся OmpA, были мишенью для протеиназы К. Вставка чужеродных пептидов не влияла на рост бактериальных клеток. Charbit et al. во-первых, определили области белка LamB, которые были «пермиссивными» для инсерции чужеродных петид (т.е. которые не приводили к полной потере функциональности белка). Затем они исследовали универсальность пермиссивных сайтов (предел размера, природа эпитопа,...), которые все были расположены в открытых петлях тримерной внешней мембраны порина, с целью разработки поливалентных живых бактериальных вакцин (12-15). Это было первое свидетельство использования методов бактериального отображения поверхности для экспрессии белков на поверхности клеток без изменения функции клетки.

Пептиды очень полезны в качестве терапевтических и диагностических веществ. Их использование становится все более популярным, а системы отображения предлагают полезный способ конструировать пептиды и оптимизировать их связывающие способности. Клетки экспрессируют поверхностные белки, которые могут участвовать во множестве ответов, включая распознавание других клеток, взаимодействие с другими клетками и передачу сигналов. Многие типы бактерий имеют белки клеточной поверхности, такие как энтеропатогенный E. coli белок intimin, который участвует в связывании с клетками-хозяевами, или белок OmpA клеток E. coli, который важен для сохранения структуры внешней мембраны. Многие поверхностные белки участвуют в прикреплении бактериальных клеток и вторжении в хозяйскую клетку. Используя бактериальный дисплей, можно идентифицировать целевые белки на клетке-хозяине. Эти поверхностные белки необходимо сначала переместить через мембраны бактериальных клеток из цитоплазмы на поверхность клетки. Грамотрицательные бактерии имеют дополнительное периплазматическое пространство, которого грамположительные бактерии отсутствуют, поэтому перед ними стоит более сложная задача по перемещению белков. Отображение гетерологичных белков на поверхности бактериальной клетки обычно требует слияния белка с поверхностным белком, называемого каркасом.

Система аутотранспортера (система секреции типа V)

Каркас

Каркасы используются для отображения гетерологичного белка на поверхности бактериальной клетки. Были использованы различные каркасы, такие как белки внешней мембраны, белки фимбрий / жгутиков и CPX (OmpX с циркулярной перестановкой). Каркас CPX позволяет слияние пептидов на обоих концах каркаса.

OMP представляют собой обычные каркасы для бактериального дисплея. Белки также могут отображаться на поверхности бактериальных клеток за счет использования автотранспортеров. Автотранспортеры являются частью системы секреции типа V. Обычно они имеют три домена: лидерную последовательность на N-конце; центральная пассажирская зона; автотранспортерный домен на С-конце. Гетерологичный белок вставлен в пассажирский домен. Другой метод слияния гетерологичных белков - слияние с фимбриями / жгутиками, которые представляют собой нитчатые выступы на поверхности клетки. Существует много фимбрий в основном на грамотрицательных бактериях, поэтому отображение белков на фимбриях выгодно по сравнению с некоторыми другими поверхностными белками, которых меньше. Недостатком использования фимбрий является то, что существует относительно небольшой предел размера вставки в 10-30 аминокислот.

Проточный цитометр

После слияния гетерологичного белка с белком поверхности бактериальной клетки он подвергается воздействию либо к ферменту, клетке (экспрессирующей целевой белок), либо к антителу (обычно с флуоресцентной меткой ), в зависимости от применения эксперимента. Затем образец пропускается через луч света во время FACS в очень узком потоке жидкости, так что только одна клетка может проходить за раз, и испускаемая флуоресценция обнаруживается. Информация о размере клетки может быть получена путем рассеяния света, и если произошло связывание гетерологичного белка с целевым белком / клеткой, испускается больше флуоресценции.

Отображение бактериальной поверхности можно использовать для множества приложений. К ним относятся скрининг на основе аффинности, картирование эпитопа антитела , идентификация пептидных субстратов, идентификация связывающихся с клетками пептидов и создание вакцины.

Скрининг на основе аффинности

Скрининг используется для выявления очевидного сродства гетерологичных белков на поверхности бактериальных клеток к целевым белкам. Этот метод обычно сочетается с FACS, и добавление нефлуоресцентного конкурента целевого белка полезно для получения более точных аффинностей связывания. Добавление конкурента снижает вероятность повторного связывания белков-мишеней, что делает аффинность связывания менее точной.

Картирование эпитопа антитела

Картирование эпитопа антитела используют для определения специфичности антитела. Эпитоп (сайт связывания антител антигенов) экспрессируется на поверхности бактериальной клетки путем экспрессии области гена, кодирующего антиген. Проточная цитометрия с флуоресцентно меченными антителами используется для определения количества антител, связывающихся с эпитопом.

Идентификация пептидных субстратов

Это можно применять для поиска лучших субстратов для протеолитических ферментов. Субстрат отображается на поверхности бактериальной клетки между аффинным лигандом и каркасом, и кинетика протеолиза субстрата измеряется с помощью FACS.

Идентификация клеточно-связывающих пептидов

Бактериальный дисплей можно использовать для поиска пептидов, которые связываются с конкретными клетками, например клетки рака груди или стволовые клетки. Отображаемые белки флуоресцентно помечены GFP, поэтому связывающие взаимодействия между пептидами и клетками-мишенями можно увидеть с помощью проточной цитометрии. Контрольные образцы необходимы для измерения уровней флуоресценции в отсутствие отображаемых пептидов. Также требуются образцы, которые не содержат отображаемых пептидов, но содержат клетки млекопитающих и бактериальные клетки (включая каркас).

Доставка вакцины

Доставка вакцины - это очень распространенное применение демонстрации бактериальной поверхности. Существует два типа живых бактериальных вакцин, которые могут быть изготовлены:

1. Обычно патогенные бактерии ослаблены, поэтому они больше не являются патогенными.
2. Commensal или пищевые бактерии, которые не являются патогенными

Использование бактериальной поверхностной демонстрации антигенов является ценной альтернативой традиционному дизайну вакцины по разным причинам, одна из которых заключается в том, что белки, экспрессируемые на поверхности бактериальных клеток, могут благоприятно действовать как адъювант. Обычные вакцины требуют добавления адъювантов. Еще одно преимущество создания вакцин с использованием бактериальных дисплейных систем состоит в том, что целая бактериальная клетка может быть включена в живую вакцину. В отличие от бактериофаговых дисплейных систем, которые обычно используются при разработке вакцин для поиска неизвестных эпитопов, бактериальные дисплейные системы используются для экспрессии известных эпитопов и клеток. действуют как система доставки вакцины.

В аналогичных условиях доказан выбор пептидов с бактериальным дисплеем в качестве модели белка стрептавидина хуже.

1. ^Кенрик С.А., Догерти П.С. (2010). «Бактериальный дисплей обеспечивает эффективное и количественное созревание пептидного сродства». Protein Eng Des Sel. 23(1): 9–17. doi : 10.1093 / протеин / gzp065. PMC 2791049. PMID 19903738.
2. ^Фрейдл Р., Макинтайр С., Деген М., Хеннинг У. (1986). "Воздействие на клеточную поверхность белка OmpA внешней мембраны Escherichia coli K-12". J Mol Biol. 188 (3): 491–4. DOI : 10.1016 / 0022-2836 (86) 90171-3. PMID 3525847.
3. ^Ван И (2002). «Функция OmpA в Escherichia coli». Biochem Biophys Res Commun. 292 (2): 396–401. DOI : 10.1006 / bbrc.2002.6657. PMID 11906175.
4. ^Getz JA, Schoep TD, Daugherty PS (2012). «Открытие пептидов с использованием бактериального дисплея и проточной цитометрии». Белковая инженерия для терапии, часть B. Методы Enzymol. Методы в энзимологии. 503 . С. 75–97. DOI : 10.1016 / B978-0-12-396962-0.00004-5. ISBN 9780123969620. PMID 22230566.
5. ^Вернерус Х., Шталь С. (2004). «Биотехнологические применения бактерий поверхностной инженерии». Biotechnol Appl Biochem. 40(Pt 3): 209–28. DOI : 10.1042 / BA20040014. PMID 15035661. S2CID 9395029.
6. ^Клемм П., Шембри М.А. (2000). «Бактериальные адгезины: функция и структура». Int J Med Microbiol. 290 (1): 27–35. DOI : 10.1016 / S1438-4221 (00) 80102-2. PMID 11043979.
7. ^Догерти П.С. (2007). «Белковая инженерия с бактериальным дисплеем». Curr Opin Struct Biol. 17(4): 474–80. doi : 10.1016 / j.sbi.2007.07.004. PMID 17728126.
8. ^Рокберг Дж., Лофблом Дж., Хьельм Б., Улен М., Шталь С. (2008). «Картирование эпитопа антител с использованием дисплея бактериальной поверхности». Nature Methods. 5(12): 1039–45. doi : 10.1038 / nmeth.1272. PMID 19029907. S2CID 12078882.
9. ^Вестерлунд-Викстром B (2000). «Пептидный дисплей на бактериальных жгутиках: принципы и применение». Int J Med Microbiol. 290 (3): 223–30. DOI : 10.1016 / S1438-4221 (00) 80119-8. PMID 10959724.
10. ^Бенхар I (2001). «Биотехнологические применения фагов и клеточного дисплея». Успехи биотехнологии. 19(1): 1–33. DOI : 10.1016 / S0734-9750 (00) 00054-9. PMID 14538090.
11. ^Ландер и др. (2005). «Сравнение бактериальных и фаговых пептидных библиотек в поисках связанного с мишенью мотива». Прикладная биохимия и биотехнология. 127 (2): 125–131. DOI : 10.1385 / ABAB: 127: 2: 125. PMID 16258189. S2CID 45243314.

12. Charbit A, Boulain JC, Ryter A, Hofnung M. Исследование топологии бактериального мембранного белка путем генетической вставки чужеродного эпитопа; экспрессия на поверхности клетки. EMBO J. 1986, ноябрь; 5 (11): 3029-37.

13. Charbit A, Sobczak E, Michel ML, Molla A, Tiollais P, Hofnung M. Представление двух эпитопов области preS2 вируса гепатита B на живых рекомбинантных бактериях. J Immunol. 1987, сентябрь 1; 139 (5): 1658-64.

14. Чарбит А, Молла А., Саурин В., Хофнунг М. Универсальность вектора для экспрессии чужеродных полипептидов на поверхности грамотрицательных бактерий. Ген. 15 октября 1988 г.; 70 (1): 181-9.

15. Ньютон С.М., Клебба П.Е., Мишель В., Хофнунг М., Чарбит А. Топология мембранного белка LamB по метке эпитопа и сравнение с рентгеновской моделью. J Bacteriol. 1996 июн; 178 (12): 3447-56.