Войти
Транспозаза - это фермент, который связывается с концом транспозона и катализирует его перемещение в другую часть генома с помощью механизма вырезания и вставки или механизма репликативной транспозиции. Слово «транспозаза» впервые было придумано людьми, которые клонировали фермент, необходимый для транспозиции транспозона Tn3. Существование транспозонов было постулировано в конце 1940-х годов Барбарой МакКлинток, которая изучала наследование кукурузы, но настоящая молекулярная основа транспозиции была описана более поздними группами. МакКлинток обнаружил, что части хромосом меняют свое положение, перескакивая с одной хромосомы на другую. Репозиционирование этих транспозонов (которые кодировали цвет) позволило экспрессировать другие гены пигмента. Перемещение кукурузы вызывает изменение цвета; однако у других организмов, таких как бактерии, он может вызывать устойчивость к антибиотикам. Транспозиция также важна для создания генетического разнообразия внутри видов и способности адаптироваться к изменяющимся условиям жизни. В ходе эволюции человека до 40% генома человека перемещалось с помощью таких методов, как транспозиция транспозонов.
Транспозазы классифицируются под номером ЕС EC 2.7.7.
Гены, кодирующие транспозазы, широко распространены в геномах большинства организмов и являются наиболее распространенными из известных генов.
| Димеризационный домен транспозазы Tn5 | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Транспозаза tn5: 20-мерный внешний конец 2-минутный комплекс | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Символ | Dimer_Tnp_Tn5 | ||||||||
| Pfam | PF02281 | ||||||||
| InterPro | IPR003201 | ||||||||
| SCOPe | 1b7e / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Транспозаза (Tnp) Tn5 является членом суперсемейства белков РНКазы, которое включает ретровирусные интегразы. Tn5 можно найти в бактериях Shewanella и Escherichia. Транспозоны кодируют устойчивость к антибиотикам канамицину и другим аминогликозидным антибиотикам.
Tn5 и другие транспозазы заметно неактивны. Поскольку события транспозиции ДНК по своей сути являются мутагенными, низкая активность транспозаз необходима для снижения риска возникновения фатальной мутации у хозяина и, таким образом, устранения мобильного элемента. Одна из причин, по которой Tn5 настолько инертен, заключается в том, что N- и C-концы расположены в относительно непосредственной близости друг от друга и имеют тенденцию ингибировать друг друга. Это было выяснено путем характеристики нескольких мутаций, которые привели к гиперактивным формам транспозаз. Одна из таких мутаций, L372P, представляет собой мутацию аминокислоты 372 в транспозазе Tn5. Эта аминокислота обычно представляет собой остаток лейцина в середине альфа-спирали. Когда этот лейцин заменяется остатком пролина, альфа-спираль разрывается, вводя конформационные изменения в C-концевой домен, отделяя его от N-концевого домена, достаточное для обеспечения более высокой активности белка. Для транспозиции транспозона часто требуются только три части: транспозон, фермент транспозаза и целевая ДНК для вставки транспозона. Так обстоит дело с Tn5, который использует механизм вырезания и вставки для перемещения транспозонов.
Tn5 и большинство других транспозаз содержат мотив DDE, который является активным сайтом, который катализирует движение транспозона. Аспартат-97, аспартат-188 и глутамат-326 составляют активный центр, который представляет собой триаду кислотных остатков. Считается, что мотив DDE координирует ионы двухвалентных металлов, чаще всего магния и марганца, которые играют важную роль в каталитической реакции. Поскольку транспозаза невероятно неактивна, область DDE мутирует, так что транспозаза становится гиперактивной и катализирует движение транспозона. Глутамат превращается в аспартат, а два аспартата - в глутаматы. Благодаря этой мутации становится возможным изучение Tn5, но в результате теряются некоторые этапы каталитического процесса.
Есть несколько этапов, которые катализируют движение транспозона, включая связывание Tnp, синапсис (создание синаптической системы). комплекс), расщепление, захват мишени и перенос цепи. Затем транспозаза связывается с цепью ДНК и создает зажим на конце транспозона ДНК и вставляется в активный сайт. Как только транспозаза связывается с транспозоном, она производит синаптический комплекс, в котором две транспозазы связаны в цис / транс-отношениях с транспозоном.
При расщеплении ионы магния активируют кислород из молекул воды и подвергают их воздействию нуклеофильная атака. Это позволяет молекулам воды надрезать 3'-цепи на обоих концах и создать шпильку, которая отделяет транспозон от донорской ДНК. Затем транспозаза перемещает транспозон в подходящее место. О захвате мишени известно немного, хотя существует систематическая ошибка последовательности, которая еще не определена. После захвата мишени транспозаза атакует целевую ДНК на расстоянии девяти пар оснований, что приводит к интеграции транспозона в целевую ДНК.
Как упоминалось ранее, из-за мутаций DDE некоторые этапы процесса теряются - например, когда этот эксперимент проводится in vitro, и тепловая обработка SDS денатурирует транспозазу. Однако все еще не ясно, что происходит с транспозазой in vivo.
Исследование транспозазы Tn5 имеет общее значение из-за ее сходства с ВИЧ -1 и другими ретровирусными заболеваниями. Изучая Tn5, можно многое узнать о других транспозазах и их активности.
Tn5 используется при секвенировании генома с помощью Tn5 для присоединения адаптеров секвенирования и фрагментации ДНК в одной ферментативной реакции, сокращая время и входные требования по сравнению с традиционным секвенированием следующего поколения. Это средство подготовки библиотеки используется в методике ATAC-seq, а также в секвенировании красителя Illumina.
Транспозаза Sleeping Beauty (SB) является рекомбиназа, которая управляет транспозонной системой Спящей красавицы. Транспозаза SB принадлежит к семейству транспозаз DD [E / D], которые, в свою очередь, принадлежат к большому суперсемейству полинуклеотидилтрансфераз, которое включает РНКазу H, резольвазу RuvC Холлидея, белки RAG и ретровирусные интегразы. Система SB используется в основном у позвоночных животных для переноса генов, включая генную терапию и открытие генов. Сконструированный SB100X представляет собой фермент, который управляет высокими уровнями интеграции транспозона.
Транспозон Tn7 представляет собой мобильный генетический элемент, обнаруженный во многих прокариотах, таких как Escherichia coli (E. coli), и впервые была обнаружена как последовательность ДНК в бактериальных хромосомах и встречающихся в природе плазмидах, которые кодировали устойчивость к антибиотикам триметоприм и стрептомицин. В частности, классифицируется как мобильный элемент (транспозон), последовательность может дублироваться и перемещаться внутри генома за счет использования самокодирующегося фермента рекомбиназы, называемого транспозазой, что приводит к таким эффектам, как создание или обращение мутаций и изменение генома. размер. Транспозон Tn7 разработал два механизма, способствующих его распространению среди прокариот. Подобно многим другим бактериальным транспозонам, Tn7 переносится с низкой частотой и встраивается во множество различных сайтов с небольшой сайт-селективностью или без нее. По этому первому пути Tn7 предпочтительно направляется в конъюгированные плазмиды, которые могут реплицироваться и распространяться между бактериями. Тем не менее, Tn7 уникален тем, что он также с высокой частотой переносится в один специфический сайт бактериальных хромосом, называемый attTn7. Эта специфическая последовательность является важным и высококонсервативным геном, обнаруженным во многих штаммах бактерий. Однако рекомбинация не является вредной для бактерии-хозяина, поскольку Tn7 фактически перемещается ниже гена после его распознавания, что приводит к безопасному способу размножения транспозона без гибели хозяина. Этот высокоразвитый и сложный путь отбора сайтов-мишеней предполагает, что этот путь эволюционировал, чтобы способствовать сосуществованию транспозона и его хозяина, а также успешной передачи Tn7 будущим поколениям бактерий.
Транспозон Tn7 имеет длину 14 т.п.н. кодирует пять ферментов. Концы ДНК-последовательности состоят из двух сегментов, с которыми транспозаза Tn7 взаимодействует во время рекомбинации. Левый сегмент (Tn7-L) имеет длину 150 п.н., а правая последовательность (Tn7-R) - длину 90 п.н. Оба конца транспозона содержат серию из 22 п.н. сайтов связывания, которые транспозаза Tn7 распознает и с которыми связывается. Внутри транспозона находятся пять дискретных генов, кодирующих белки, составляющие механизм транспозиции. Кроме того, транспозон содержит интегрон, сегмент ДНК, содержащий несколько кассет генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам.
Транспозон Tn7 кодирует пять белков: TnsA, TnsB, TnsC, TnsD и TnsE. TnsA и TnsB взаимодействуют вместе с образованием фермента транспозазы Tn7 TnsAB. Фермент специфически распознает и связывается с концами последовательности ДНК транспозона и вырезает ее, вводя разрывы двухцепочечной ДНК на каждый конец. Вырезанная последовательность затем вставляется в другой сайт-мишень ДНК. Подобно другим охарактеризованным транспозонам, механизм транспозиции Tn7 включает отщепление 3'-концов донорной ДНК белком TnsA транспозазы TnsAB. Однако Tn7 также однозначно расщепляется около 5'-концов, примерно на 5 п.н. от 5'-конца в направлении транспозона Tn7, белком TnsB TnsAB. После вставки транспозона в целевой сайт ДНК 3'-концы ковалентно связаны с целевой ДНК, но на 5'-концах все еще присутствуют промежутки в 5 п.н. В результате восстановление этих разрывов приводит к дальнейшей дупликации 5 п.н. на целевом сайте. Белок TnsC взаимодействует с ферментом транспозазы и целевой ДНК, способствуя процессам вырезания и вставки. Способность TnsC активировать транспозазу зависит от ее взаимодействия с целевой ДНК вместе с соответствующим нацеливающим белком, TnsD или TnsE. Белки TnsD и TnsE являются альтернативными селекторами мишеней, которые также являются ДНК-связывающими активаторами, которые способствуют вырезанию и встраиванию Tn7. Их способность взаимодействовать с конкретной целевой ДНК является ключом к выбору целевого сайта Tn7. Таким образом, белки TnsA, TnsB и TnsC образуют основной аппарат Tn7: TnsA и TnsB взаимодействуют вместе с образованием транспозазы, в то время как TnsC функционирует как регулятор активности транспозазы, связываясь между транспозазой и TnsD и TnsE. Когда белок TnsE взаимодействует с центральным аппаратом TnsABC, Tn7 предпочтительно направляет вставки в конъюгированные плазмиды. Когда белок TnsD взаимодействует с TnsABC, Tn7 предпочтительно направляет инсерции вниз по течению в один важный и высококонсервативный сайт в бактериальной хромосоме. Этот сайт, attTn7, специально признан TnsD.
.
