Войти
Микроскопия силы тяги (TFM) - это экспериментальный метод для определения тяги на поверхности биологической клетки путем измерения окружающего поля смещения внутри внеклеточного матрикса (ECM) in vitro .
Известно, что динамическое механическое поведение взаимодействий клетка-ЕСМ и клетка-клетка диапазон клеточных функций, включая некроз, дифференцировку, адгезию, миграцию, локомоцию и рост. TFM использует экспериментально наблюдаемые смещения ECM для расчета тяги или вектора напряжения на поверхности клетки. До TFM исследователи наблюдали растяжение клеток на подложках из силиконового каучука, сморщивающихся вокруг клеток; однако точная количественная оценка тяги в такой технике затруднена из-за нелинейного и непредсказуемого поведения складок. Несколько лет спустя была введена терминология TFM для описания более продвинутой вычислительной процедуры, которая была создана для преобразования измерений деформации субстрата в расчетное растягивающее напряжение.
В традиционном TFM клеточные культуры засевают на или внутри оптически прозрачного 3D ECM, залитого флуоресцентными микросферами (обычно латексные шарики с диаметром в диапазоне от 0,2 до 1 мкм ). Для этой цели можно использовать широкий спектр природных и синтетических гидрогелей при условии, что механическое поведение материала хорошо охарактеризовано, и гидрогель способен поддерживать жизнеспособность клеток. Клетки будут прилагать свои собственные силы к этому субстрату, который, следовательно, будет смещать шарики в окружающем ECM. В некоторых исследованиях детергент, фермент или лекарство используются для нарушения цитоскелета, тем самым изменяя, а иногда и полностью устраняя, тяги, создаваемые клеткой.
Во-первых, непрерывное поле смещения вычисляется из пары изображений: первое изображение представляет собой эталонную конфигурацию микросфер, окружающих изолированную ячейку, а второе изображение представляет собой ту же изолированную ячейку, окруженную микросферами, которые теперь смещены. из-за клеточной тяги. Конфокальная флуоресцентная микроскопия обычно используется для изображения поверхности клетки и флуоресцентных шариков. После вычисления поля поступательного смещения между деформированной и недеформированной конфигурацией можно вычислить поле деформации. Из поля деформаций можно рассчитать поле напряжений, окружающее ячейку, с учетом поведения напряженно-деформированного состояния или основной модели окружающего гидрогелевого материала. Можно продвинуться на один шаг дальше и использовать поле напряжений для вычисления тяговых усилий на поверхности ячейки, если векторы нормали к поверхности ячейки могут быть получены из набора трехмерных изображений . Хотя эта процедура является обычным способом получения клеточного сцепления из смещения микросферы, в некоторых исследованиях успешно использовался обратный вычислительный алгоритм для получения поля сцепления.
Пространственное разрешение тяги поле, которое можно восстановить с помощью TFM, ограничено количеством измерений смещения на площадь. Расстояние между независимыми измерениями смещения варьируется в зависимости от экспериментальных установок, но обычно составляет порядка одного микрометра. Рисунки тяги, создаваемые клетками, часто содержат локальные максимумы и минимумы меньшего размера. Обнаружение этих мелких изменений в локальном клеточном тракте с TFM остается сложной задачей.
В 2D TFM клетки культивируют в виде монослоя на поверхности тонкого субстрата с регулируемой жесткостью, а микросферы - у поверхности субстрата. претерпевают деформацию через связи ячейка-ECM. Культуры клеток 2.5D аналогичным образом выращивают поверх тонкого слоя ЕСМ, и разбавленные структурные белки ЕСМ смешивают с средой, добавленной над клетками и субстратом. Хотя большая часть основополагающей работы в TFM была выполнена в 2D или 2.5D, многие типы клеток требуют сложных биофизических и биохимических сигналов от 3D ECM, чтобы вести себя действительно физиологически реалистичным образом в среде in vitro.
Когда вращение или растяжение вспомогательного объема велико, могут быть внесены ошибки в расчет сцепления поверхности ячеек, поскольку большинство методов TFM используют вычислительную структуру, основанную на линейной упругости. Последние достижения в области TFM показали, что ячейки способны проявлять деформации с величиной деформации до 40%, что требует использования подхода теории конечных деформаций для учета больших величин деформации.
Хотя TFM часто используется для наблюдения за сцеплением на поверхности пространственно изолированной отдельной клетки, вариант TFM также может использоваться для анализа коллективного поведения многоклеточных систем. Например, скорости клеточной миграции и плитотаксис наблюдаются вместе с рассчитанной картой изменения напряжения однослойного слоя клеток в подходе, называемом микроскопией напряжения монослоя. Механическое поведение отдельных клеток по сравнению со сливным слоем клеток отличается тем, что монослой находится в состоянии «перетягивания каната». Также имеются данные о перераспределении тракций, которое может происходить раньше, чем изменения полярности клеток и миграции.
TFM также оказался особенно полезным для изучения дуротаксиса..
TFM недавно был применен для изучения механики инвазии раковых клеток с гипотезой о том, что клетки, которые генерируют большие тракции, более инвазивны, чем клетки с более низкими трактами. Также есть надежда, что недавние открытия TFM внесут вклад в разработку оптимальных каркасов для тканевой инженерии и регенерации периферической нервной системы, трансплантатов артерий и эпителиальные клетки кожи.
