Войти
 Прототип иммуноферментного метода объемного оптического волокна | |
| Акроним | СОФИЯ |
|---|---|
| Использует | Медицина, безопасность пищевых продуктов, промышленность, ветеринария |
| Известные эксперименты | Обнаружение прионов в моче и крови доклинических носителей |
| Изобретатель | Лос-Аламосская национальная лаборатория и SUNY |
| Модель | Прототип |
Иммуноанализ с объемным оптическим волокном ( SOFIA) - это сверхчувствительная платформа для диагностики in vitro, включающая узел объемного оптического волокна, который улавливает флуоресцентное излучение всего образца. Определяющими характеристиками технологии являются чрезвычайно высокий предел обнаружения, чувствительность и динамический диапазон. Чувствительность SOFIA измеряется на уровне аттограмм (10 −18 г), что делает ее примерно в миллиард раз более чувствительной, чем традиционные методы диагностики. Благодаря расширенному динамическому диапазону SOFIA может различать уровни анализируемого вещества в образце более 10 порядков, что способствует точному титрованию.
В качестве диагностической платформы SOFIA имеет широкий спектр приложений. Несколько исследований уже продемонстрировали беспрецедентную способность SOFIA обнаруживать встречающиеся в природе прионы в крови и моче носителей болезней. Ожидается, что это приведет к созданию первого надежного предубойного скринингового теста на vCJD, BSE, scrapie, CWD и других трансмиссивных губчатых энцефалопатиях. Учитывая чрезвычайную чувствительность технологии, ожидается появление дополнительных уникальных приложений, включая тесты in vitro на другие нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера и Паркинсона.
SOFIA была разработана в результате совместного исследовательского проекта между Национальной лабораторией Лос-Аламоса и Государственным университетом Нью-Йорка при поддержке Национальной программы исследования прионов Министерства обороны США.
Обычный метод выполнения лазерно-индуцированной флуоресценции, а также других типов спектроскопических измерений, таких как инфракрасная, ультрафиолетовая и видимая спектроскопия, фосфоресценция и т. Д., Заключается в использовании небольшого прозрачного лабораторного сосуда, кюветы, в котором помещается образец для быть проанализированы.
Для проведения измерения кювета заполняется исследуемой жидкостью, а затем освещается лазером, сфокусированным через одну из граней кюветы. Линза размещается на одной из сторон кюветы, расположенной под углом 90 ° от входного окна, для сбора индуцированного лазером флуоресцентного света. Только небольшой объем кюветы фактически освещается лазером и производит детектируемое спектроскопическое излучение. Выходной сигнал значительно уменьшается, поскольку линза улавливает только около 10% спектроскопического излучения из-за соображений телесного угла. Этот метод используется не менее 75 лет; еще до появления лазера, когда для возбуждения флуоресценции использовались обычные источники света.
SOFIA решает проблему низкой эффективности улавливания, поскольку собирает почти весь флуоресцентный свет, производимый анализируемым образцом, увеличивая количество сигнала флуоресценции примерно в 10 раз по сравнению с обычным устройством.
SOFIA - это устройство и метод улучшенной оптической геометрии для улучшения спектроскопического обнаружения аналитов в образце. Изобретение уже продемонстрировало свои функциональные возможности в качестве устройства и способа сверхчувствительного обнаружения прионов и других аналитов низкого уровня. SOFIA сочетает в себе специфичность, присущую моноклональным антителам для захвата антигена, с чувствительностью технологии объемного оптического обнаружения. Для обнаружения чрезвычайно низких уровней сигнала в качестве детектора системы используется малошумящий фотоэлектрический диод. SOFIA использует лазер для освещения микрокапиллярной трубки, в которой находится образец. Затем свет, собранный от образца, направляется на переносную оптику от оптических волокон. Затем свет оптически фильтруется для обнаружения, которое выполняется как измерение тока, усиленное против шума с помощью синхронизированного усиления цифровой обработки сигнала. Результаты отображаются на компьютере и программном обеспечении, предназначенном для сбора данных.
У такой детекторной матрицы множество преимуществ. Прежде всего, это позволяет оптимально исследовать очень маленькие образцы с низкой концентрацией с использованием метода лазерно-индуцированной флуоресценции. Эта система обнаружения на основе волокна может быть адаптирована к существующему оборудованию для обнаружения с короткими импульсами, которое изначально было разработано для секвенирования отдельных молекул ДНК. Геометрия также подходит для использования в схемах обнаружения одиночных молекул с помощью лазера с короткими импульсами. Многопортовая геометрия системы позволяет осуществлять эффективную электронную обработку сигналов от каждого плеча устройства. Наконец, что, возможно, наиболее важно, оптоволоконные кабели по существу на 100% эффективны при оптической передаче, имея затухание менее 10 дБ / км. Таким образом, после развертывания для использования на объекте информация о флуоресценции может быть передана оптоволоконным путем в удаленное место, где могут выполняться обработка и анализ данных.
SOFIA содержит контейнер для образцов многолуночного планшета, автоматизированное средство для последовательной транспортировки образцов из контейнера для образцов многолуночного планшета в прозрачный капилляр, содержащийся в держателе образца, источник возбуждения, оптически связанный с образцом, при этом излучение от источника возбуждения направлено вдоль длина капилляра, в котором излучение индуцирует сигнал, который испускается из образца, и, по меньшей мере, один линейный массив.
После амплификации и последующего концентрирования целевого аналита образцы метят флуоресцентным красителем с использованием антитела для определения специфичности, а затем, наконец, загружают в микрокапиллярную трубку. Эта трубка помещена в специально сконструированное устройство, поэтому она полностью окружена оптическими волокнами, чтобы улавливать весь свет, излучаемый при возбуждении красителя с помощью лазера.
Рисунок 1: Схематическое изображение SOFIA Это оборудование представляет собой спектроскопический (светосборный) прибор и соответствующий метод для быстрого обнаружения и анализа аналитов в образце. Образец облучается источником возбуждения, оптически связанным с образцом. Источник возбуждения может включать в себя, помимо прочего, лазер, лампу-вспышку, дуговую лампу, светоизлучающий диод и т.п.
На рисунке 1 изображена текущая версия системы SOFIA. Четыре линейных массива (101) проходят от держателя образца (102), в котором находится удлиненный прозрачный контейнер для образца, открытый с обоих концов, до оконечного порта (103). Дистальный конец концевого порта (104) вставлен в узел концевого порта (200). Линейные матрицы (101) содержат множество оптических волокон, имеющих первый конец и второй конец, причем множество оптических волокон необязательно окружено защитной и / или изолирующей оболочкой. Оптические волокна расположены линейно, что означает, что они по существу копланарны по отношению друг к другу, образуя удлиненный ряд волокон.
Интересующий аналит может быть биологическим или химическим по природе и только в качестве примера может включать химические фрагменты (токсины, метаболиты, лекарственные средства и остатки лекарств), пептиды, белки, клеточные компоненты, вирусы и их комбинации. Интересующий аналит может находиться либо в жидкости, либо в поддерживающей среде, такой как гель.
SOFIA продемонстрировала свой потенциал как устройство с широким спектром приложений. К ним относятся клинические применения, такие как обнаружение заболеваний, выявление предрасположенности к патологиям, постановка диагноза и отслеживание эффективности назначенных методов лечения, а также доклинические применения, такие как предотвращение попадания токсинов и других патогенных агентов в продукты, предназначенные для потребления человеком:
SOFIA использовалась для быстрого обнаружения аномальной формы прионного белка ( PrP Sc ) в образцах жидкостей организма, таких как кровь или моча. PrP Sc является белком-маркером, используемым в диагностике трансмиссивных губчатых энцефалопатий (TSE), примерами которых являются губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (т. Е. «Коровье бешенство»), скрепи у овец и болезнь Крейтцфельда – Якоба у людей. В настоящее время не существует быстрых средств для предубойного обнаружения PrP Sc в разбавленных количествах, в которых он обычно появляется в жидкостях организма. SOFIA имеет преимущества, заключающиеся в том, что для подготовки образцов требуется небольшая подготовка, а также позволяет размещать электронное диагностическое оборудование за пределами зоны содержания.
TSE, или прионные заболевания, представляют собой инфекционные нейродегенеративные заболевания млекопитающих, которые включают губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, хроническую болезнь истощения у оленей и лосей, скрейпи у овец и болезнь Крейтцфельдта – Якоба (CJD) у людей. TSE могут передаваться от хозяина к хозяину при проглатывании инфицированных тканей или переливании крови. Клинические симптомы TSE включают потерю движений и координации и деменцию у людей. У них инкубационный период от месяцев до лет, но после появления клинических признаков они быстро прогрессируют, не поддаются лечению и неизменно приводят к летальному исходу. Попытки снизить риск TSE привели к значительным изменениям в производстве и торговле сельскохозяйственными товарами, лекарствами, косметикой, донорством крови и тканей, а также продуктами биотехнологии. Посмертное невропатологическое исследование ткани головного мозга животного или человека остается «золотым стандартом» диагностики ТГЭ и является очень специфичным, но не таким чувствительным, как другие методы.
В целях повышения безопасности пищевых продуктов, было бы полезно для скрининга всех животных для прионных заболеваний с использованием анте патологоанатомическое, доклинических испытаний, т.е. тестирования до появления симптомов. Однако уровни PrP Sc очень низкие у бессимптомных хозяев. Кроме того, PrP Sc обычно неравномерно распределяются в тканях организма, причем самые высокие концентрации постоянно обнаруживаются в тканях нервной системы, а очень низкие концентрации - в легко доступных жидкостях организма, таких как кровь или моча. Следовательно, любой такой тест может потребоваться для обнаружения чрезвычайно малых количеств PrP и должен будет дифференцировать PrP C и PrP Sc.
Современные методы обнаружения PrP Sc требуют много времени и используют посмертный анализ после того, как у подозрительных животных проявляется один или несколько симптомов заболевания. Современные методы диагностики основаны в основном на обнаружении физико-химических различий между PrP C и PrP Sc, которые на сегодняшний день являются единственными надежными маркерами TSE. Например, наиболее широко используемые диагностические тесты используют относительную устойчивость PrP Sc к протеазам в образцах мозга для различения PrP C и PrP Sc в сочетании с обнаружением на основе антител резистентной к PK части PrP Sc. Пока не удалось обнаружить прионные заболевания с помощью обычных методов, таких как полимеразная цепная реакция, серология или анализы на культуре клеток. Агент-специфическая нуклеиновая кислота еще не идентифицирована, и инфицированный хозяин не вызывает ответа антител.
Конформационно измененная форма PrP C - это PrP Sc. Некоторые группы считают, что PrP Sc является инфекционным агентом (прионным агентом) в TSE, в то время как другие группы нет. PrP Sc может быть невропатологическим продуктом болезненного процесса, компонентом инфекционного агента, самим инфекционным агентом или чем-то еще. Независимо от того, какова его действительная функция в болезненном состоянии, PrP Sc явно специфически связан с болезненным процессом, и его обнаружение указывает на инфицирование агентом, вызывающим прионные заболевания.
Помимо прочего, SOFIA предлагает методы диагностики прионных заболеваний путем обнаружения PrP Sc в биологических образцах. Образцы могут представлять собой ткань мозга, нервную ткань, кровь, мочу, лимфатическую жидкость, спинномозговую жидкость или их комбинацию. Отсутствие PrP Sc указывает на отсутствие инфекции инфекционным агентом до пределов обнаружения методов. Обнаружение присутствия PrP Sc указывает на инфекцию, связанную с прионным заболеванием. Заражение прионным агентом может быть обнаружено как на пресимптоматической, так и на симптоматической стадиях прогрессирования заболевания.
Эти и другие улучшения были достигнуты с помощью SOFIA. Чувствительность и специфичность SOFIA устраняют необходимость в PK-расщеплении, чтобы различать нормальные и аномальные изоформы PrP. Дальнейшее обнаружение PrP Sc в плазме крови было направлено на ограниченную циклическую амплификацию с неправильной укладкой белка (PMCA) с последующей SOFIA. Благодаря чувствительности SOFIA, циклы PMCA могут быть сокращены, что снижает вероятность спонтанного образования PrP Sc и обнаружения ложноположительных образцов. SOFIA отвечает потребностям повышенной чувствительности при обнаружении прионных заболеваний как у пресимптомных, так и у симптоматических животных, инфицированных TSE, включая людей, путем предоставления методов анализа с использованием высокочувствительных инструментов, которые требуют меньшего количества пробоподготовки, чем ранее описанные методы, в сочетании с недавно разработанными МАБ против ПрП. Метод данной версии SOFIA обеспечивает уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в ткани мозга. В сочетании с ограниченным sPMCA способы настоящего изобретения обеспечивают уровни чувствительности, достаточные для обнаружения PrP Sc в плазме крови, ткани и других жидкостях, собранных прижизненно.
Эти методы сочетают в себе специфичность Mab для захвата и концентрации антигена с чувствительностью технологии обнаружения объемного оптического волокна. В отличие от ранее описанных методов обнаружения PrP Sc в гомогенатах головного мозга, эти методы, при использовании для изучения гомогенатов головного мозга, не используют затравочную полимеризацию, амплификацию или ферментативное расщепление (например, протеиназой K или «PK»). Это важно, поскольку в предыдущих отчетах указывалось на существование изоформ PrP Sc с различной чувствительностью к PK, что снижает надежность анализа. Чувствительность этого анализа делает его подходящим в качестве платформы для быстрого определения прионов в биологических жидкостях. В дополнение к прионным заболеваниям этот метод может предоставить средства для быстрого и высокопроизводительного тестирования широкого спектра инфекций и расстройств.
Хотя было обнаружено, что около 40 циклов sPMCA в сочетании с иммунопреципитацией неадекватны для обнаружения PrP Sc в плазме с помощью ELISA или вестерн-блоттинга, также было обнаружено, что PrP Sc легко измеряется методами SOFIA. Ограниченное количество циклов, необходимых для данной платформы анализа, практически исключает возможность получения ложноположительных результатов, связанных с PMCA, таких как те, о которых сообщалось ранее (Thorne and Terry, 2008).
Благодаря быстрому развитию в области исследования биомаркеров многие инфекции и расстройства, которые невозможно диагностировать с помощью тестов in vitro, становятся все более возможными. Предполагается, что SOFIA будет более широко использоваться при разработке диагностических тестов для инфекций и расстройств, выходящих за рамки прионных заболеваний. Основное потенциальное применение - при других заболеваниях, связанных с неправильной упаковкой белков, в частности, при болезни Альцгеймера.
В исследовании 2011 года сообщалось об обнаружении прионов в моче от естественно и орально инфицированных овец клиническим возбудителем скрепи и орально инфицированных доклинических и инфицированных белохвостых оленей с клинической хронической болезнью истощения (CWD). Это первое сообщение об обнаружении прионов PrP Sc в моче овец или цервид с естественной или доклинической прионной болезнью.
Исследование 2010 года продемонстрировало умеренное количество циклической амплификации с неправильным сворачиванием белка (PMCA) в сочетании с новой схемой обнаружения SOFIA, может быть использовано для обнаружения PrP Sc в необработанной протеазой плазме доклинических и клинических скрейпи овец и белохвостых оленей с хроническим истощением. заболевание, возникшее в результате естественного и экспериментального заражения. Связанная с заболеванием форма прионного белка (PrP Sc), возникающая в результате конформационного изменения нормальной (клеточной) формы прионного белка (PrP C), считается центральной в нейропатогенезе и служит единственным надежным молекулярным маркером прионной болезни. диагноз. Хотя самые высокие уровни PrP Sc присутствуют в ЦНС, разработка разумного диагностического теста требует использования жидкостей организма, которые обычно содержат чрезвычайно низкие уровни PrP Sc. PrP Sc был обнаружен в крови больных животных с помощью технологии PMCA. Однако, как сообщается, повторное переключение в течение нескольких дней, необходимое для PMCA материала крови, приводит к снижению специфичности (ложноположительные результаты). Чтобы создать высокочувствительный и специфичный анализ PrP Sc в крови, исследователи использовали ограниченный серийный PMCA (sPMCA) с SOFIA. Они не обнаружили никакого усиления sPMCA при добавлении полиадениловой кислоты, и не было необходимости сопоставлять генотипы источников PrP C и PrP Sc для эффективной амплификации.
Исследование 2009 года показало, что SOFIA в ее нынешнем формате способна обнаруживать менее 10 аттограмм (г) рекомбинантного PrP хомяков, овец и оленей. Примерно 10 мкг PrP Sc из мозга хомячка, инфицированного 263K, можно обнаружить с помощью аналогичных нижних пределов обнаружения PrP Sc в мозге инфицированных скрепи овец и оленей, инфицированных хронической болезнью истощения. Эти пределы обнаружения позволяют разводить обработанный протеазой и необработанный материал до уровня, при котором PrP C, неспецифические белки или другой посторонний материал могут мешать обнаружению и / или специфичности сигнала PrP Sc. Это не только устраняет проблему специфичности обнаружения PrP Sc, но также увеличивает чувствительность, поскольку возможность частичного протеолиза PrP Sc больше не вызывает беспокойства. SOFIA, вероятно, приведет к раннему выявлению трансмиссивных энцефалопатий перед смертью, а также подходит для использования с дополнительными протоколами целевой амплификации. SOFIA представляет собой чувствительное средство для обнаружения специфических белков, участвующих в патогенезе и / или диагностике заболевания, которое выходит за рамки трансмиссивных губчатых энцефалопатий.
