Войти
Слева изображение комплекса, образованного между альфа-гемолизином и дцДНК со связью через олигомер. Справа движение этого комплекса по отношению к каналу нанопоры показано последовательно в два этапа (I) и (II). Как только комплекс вставлен в нанопору, белок альфа-гемолизин будет функционировать во вновь образованной гибридной, биологической и твердотельной системе нанопор. 
Иллюстрация того, как электрический сигнал генерируется из ДНК, проходящей через канал нанопоры. Секвенирование нанопор - это подход третьего поколения, используемый в секвенировании биополимеров, в частности, полинуклеотидов в форме ДНК или РНК.
С помощью секвенирования нанопор можно секвенировать отдельную молекулу ДНК или РНК без необходимости ПЦР амплификации или химической маркировки образца. По крайней мере, один из этих вышеупомянутых шагов необходим в процедуре любого ранее разработанного подхода к секвенированию. Секвенирование нанопор может предложить относительно низкую стоимость генотипирования, высокую мобильность для тестирования и быструю обработку образцов с возможностью отображения результатов в режиме реального времени. В публикациях по методу описывается его использование для быстрой идентификации вирусных патогенов, мониторинга эболы, мониторинга окружающей среды, мониторинга безопасности пищевых продуктов, секвенирования генома человека, секвенирования генома растений, мониторинга устойчивости к антибиотикам, гаплотипирования и другие приложения.
Биологическая или твердотельная мембрана, на которой обнаружена нанопора, окружена раствором электролита. Мембрана разделяет раствор на две камеры. Напряжение смещения прикладывается к мембране, вызывая электрическое поле, которое приводит в движение заряженные частицы, в данном случае ионы. Этот эффект известен как электрофорез. При достаточно высоких концентрациях раствор электролита хорошо распределяется, и все падения напряжения концентрируются вблизи и внутри нанопоры. Это означает, что заряженные частицы в растворе ощущают силу электрического поля только тогда, когда они находятся вблизи области поры. Эту область часто называют областью захвата. Внутри области захвата ионы совершают направленное движение, которое можно записать как установившийся ионный ток, поместив электроды рядом с мембраной. Представьте себе наноразмерный полимер, такой как ДНК или белок, помещенный в одну из камер. Эта молекула также имеет чистый заряд, который ощущает силу электрического поля, когда она находится в области захвата. Молекула приближается к этой области захвата благодаря броуновскому движению и любому притяжению, которое она может иметь к поверхности мембраны. Оказавшись внутри нанопоры, молекула перемещается через комбинацию электрофоретических, электроосмотических и иногда термофоретических сил. Внутри поры молекула занимает объем, который частично ограничивает поток ионов, наблюдаемый как падение ионного тока. В зависимости от различных факторов, таких как геометрия, размер и химический состав, изменение величины ионного тока и длительность перемещения будет варьироваться. Затем различные молекулы могут быть обнаружены и потенциально идентифицированы на основе этой модуляции ионного тока.
Величина плотности электрического тока на поверхности нанопоры зависит от размеров нанопоры и состава ДНК или РНК, которые занимают нанопору. Секвенирование стало возможным благодаря тому, что, проходя через канал нанопоры, образцы вызывают характерные изменения плотности электрического тока, протекающего через нанопору. Полный заряд, протекающий через канал нанопор, равен поверхностному интегралу потока плотности электрического тока через нормальные поверхности нанопор между временами t 1 и t 2.
Пора альфа-гемолизина (состоящая из 7 идентичных субъединиц 7 цветов) и 12-мерная одноцепочечная ДНК (в белом цвете) в той же шкале, чтобы проиллюстрировать влияние ДНК на проводимость при движении через нанопору. Ниже представлен ортогональный вид тех же молекул. Биологическое секвенирование нанопор основано на использовании трансмембранных белков, называемых поринами, которые встроены в липидные мембраны для создания размера зависимые пористые поверхности - с «дырками» нанометрового масштаба, распределенными по мембранам. Достаточно низкая скорость транслокации может быть достигнута за счет включения различных белков, которые способствуют перемещению ДНК или РНК через поры липидных мембран.
Альфа гемолизин (αHL), нанопора из бактерий, вызывающая лизис эритроцитов, изучалась более 15 лет. На данный момент исследования показали, что все четыре основания можно идентифицировать с помощью ионного тока, измеренного через пору αHL. Структура αHL полезна для идентификации конкретных оснований, движущихся через пору. Пора αHL имеет длину ~ 10 нм с двумя отдельными участками по 5 нм. Верхняя часть состоит из более крупной структуры, похожей на вестибюль, а нижняя часть состоит из трех возможных сайтов распознавания (R1, R2, R3) и способна различать каждое основание.
Секвенирование с использованием αHL было проведено разработаны путем фундаментальных исследований и структурных мутаций, продвигаясь к секвенированию очень длинных чтений. Белковая мутация αHL улучшила детектирующую способность поры. Следующим предлагаемым шагом является связывание экзонуклеазы с порами αHL. Фермент будет периодически расщеплять отдельные основания, позволяя поре идентифицировать последовательные основания. Присоединение экзонуклеазы к биологической поре замедлит транслокацию ДНК через пору и повысит точность сбора данных.
Примечательно, что теоретики показали, что секвенирование с помощью экзонуклеазных ферментов, как описано здесь, невозможно. Это в основном связано с эффектами диффузии, накладывающими ограничение на вероятность захвата каждого нуклеотида при его расщеплении. Это приводит к значительной вероятности того, что нуклеотид либо не захватывается до того, как он диффундирует в массу, либо захватывается не по порядку, и, следовательно, не будет должным образом секвенирован нанопорой, что приведет к ошибкам вставки и удаления. Следовательно, прежде чем этот метод можно будет считать жизнеспособной стратегией, необходимо внести серьезные изменения в этот метод.
Недавнее исследование указало на способность αHL обнаруживать нуклеотиды в двух отдельных сайтах в нижней половине поры. Сайты R1 и R2 позволяют дважды контролировать каждую базу по мере ее движения через пору, создавая 16 различных измеримых значений ионного тока вместо 4. Этот метод улучшает однократное считывание через нанопору, удваивая количество сайтов, на которые считывается последовательность. нанопора.
Mycobacterium smegmatis порин A (MspA) - вторая биологическая нанопора, которая в настоящее время исследуется для секвенирования ДНК. Пора MspA была определена как потенциальное улучшение по сравнению с αHL благодаря более благоприятной структуре. Пора описывается как кубок с толстым ободком и диаметром 1,2 нм на дне поры. Природный MspA, хотя и благоприятен для секвенирования ДНК из-за формы и диаметра, имеет отрицательное ядро, которое запрещает транслокацию одноцепочечной ДНК (оцДНК). Природная нанопора была модифицирована для улучшения транслокации путем замены трех отрицательно заряженных аспарагиновых кислот нейтральными аспарагинами.
Было показано, что определение нуклеотидов через мембрану электрическим током в десять раз более специфично, чем αHL для определения баз. Используя эту улучшенную специфичность, группа из Вашингтонского университета предложила использовать двухцепочечную ДНК (дцДНК) между каждой одноцепочечной молекулой для удержания основания в считывающем участке поры. ДцДНК остановила бы основание в правильном участке поры и позволила бы идентифицировать нуклеотид. Недавно был присужден грант в сотрудничестве с Калифорнийским университетом в Санта-Круз, Вашингтонским университетом и Северо-Восточным университетом для улучшения распознавания оснований MspA с использованием полимеразы phi29 в сочетании с порами.
Подходы к твердотельному секвенированию нанопор, в отличие от биологического секвенирования нанопор, не включают белки в свои системы. Вместо этого в технологии твердотельных нанопор используются подложки из различных металлов или металлических сплавов с порами нанометрового размера, через которые проходит ДНК или РНК. Эти субстраты чаще всего выполняют неотъемлемую роль в распознавании последовательностей нуклеиновых кислот, поскольку они перемещаются по каналам вдоль субстратов.
Рисунок, показывающий теоретическое движение оцДНК через систему нанопор туннельного тока. Обнаружение стало возможным благодаря встраиванию электродов вдоль стенок каналов нанопор - перпендикулярно вектору скорости оцДНК. Измерение туннелирования электронов через основания, когда оцДНК перемещается через нанопоры, является улучшенным методом твердотельного секвенирования нанопор. Большинство исследований было сосредоточено на доказательстве того, что основания могут быть определены с помощью электронного туннелирования. Эти исследования проводились с использованием сканирующего зондового микроскопа в качестве чувствительного электрода и доказали, что основания могут быть идентифицированы с помощью определенных туннельных токов. После подтверждения принципа исследования должна быть создана функциональная система для соединения твердотельных пор и сенсорных устройств.
Исследователи из Гарвардской группы нанопор сконструировали твердые поры с однослойными углеродными нанотрубками по диаметру поры. Создаются массивы пор, и химическое осаждение из паровой фазы используется для создания нанотрубок, которые растут через массив. После того, как нанотрубка выросла через пору, диаметр поры доводят до желаемого размера. Успешное создание нанотрубки, связанной с порой, является важным шагом на пути к идентификации оснований, поскольку оцДНК перемещается через твердотельную пору.
Другой метод - использование наноэлектродов по обе стороны от поры. Электроды специально созданы, чтобы обеспечить образование твердотельных нанопор между двумя электродами. Эта технология может использоваться не только для определения оснований, но и для контроля скорости перемещения и ориентации оснований.
Была разработана эффективная методика определения последовательности ДНК с использованием твердотельных нанопор и флуоресценции. Этот метод флуоресцентного секвенирования преобразует каждое основание в характерное представление множества нуклеотидов, которые связываются с дцДНК, образующей цепь флуоресцентного зонда. В предлагаемой двухцветной системе каждое основание идентифицируется двумя отдельными флуоресценциями и поэтому будет преобразовано в две определенные последовательности. Зонды состоят из флуорофора и гасителя в начале и конце каждой последовательности соответственно. Каждый флуорофор будет погашен гасителем в конце предыдущей последовательности. Когда дцДНК перемещается через твердотельную нанопору, нить зонда будет удалена, и расположенный выше флуорофор будет флуоресцировать.
Этот метод секвенирования имеет производительность 50-250 оснований в секунду на пору, а четырехцветная флуорофорная система (каждое основание может быть преобразовано в одну последовательность вместо двух), будет секвенировать более 500 оснований в секунду. Преимущества этого метода основаны на четком считывании последовательности - использовании камеры вместо методов зашумленного тока. Однако этот метод требует подготовки образца для преобразования каждой базы в расширенный двоичный код перед секвенированием. Вместо того, чтобы идентифицировать одно основание при его перемещении через поры, требуется ~ 12 оснований, чтобы найти последовательность одного основания.
| Биологические | Твердые тела | |
| Низкая скорость перемещения | ✓ | |
| Воспроизводимость размеров | ✓ | |
| Устойчивость к стрессу | ✓ | |
| Долговечность | ✓ | |
| Простота изготовления | ✓ |
Биологическое секвенирование нанопор s Системы обладают несколькими фундаментальными характеристиками, которые делают их выгодными по сравнению с твердотельными системами, при этом каждая из преимуществ этого подхода к проектированию проистекает из включения белков в их технологию. Равномерная структура пор, точный контроль перемещения образца по поровым каналам и даже обнаружение отдельных нуклеотидов в образцах могут быть облегчены с помощью уникальных белков из различных типов организмов.
Использование белков в биологических системах секвенирования нанопор, несмотря на различные преимущества, также имеет некоторые отрицательные характеристики. Чувствительность белков в этих системах к локальному стрессу окружающей среды имеет большое влияние на долговечность единиц в целом. Одним из примеров является то, что моторный белок может распаковывать образцы только с достаточной скоростью в определенном диапазоне pH, при этом не работая достаточно быстро за пределами диапазона - это ограничение влияет на функциональность всего блока секвенирования. Другой пример - трансмембранный порин может надежно работать только в течение определенного количества прогонов, прежде чем он разрушится. Оба этих примера должны быть учтены при разработке любой жизнеспособной системы биологических нанопор - чего может быть трудно достичь, сохраняя при этом затраты на такую технологию как можно более низкими и конкурентоспособными по сравнению с другими системами, насколько это возможно.
Одной из проблем метода «цепочечного секвенирования» была доработка метода с целью улучшения его разрешения, чтобы можно было обнаруживать отдельные основания. В методах ранних работ нуклеотид нужно было повторять в последовательности примерно 100 раз подряд, чтобы произвести измеримое изменение характеристики. Такое низкое разрешение связано с тем, что нить ДНК быстро перемещается через нанопору со скоростью от 1 до 5 мкс на основание. Это делает запись трудной и подверженной фоновому шуму, не позволяя получить однонуклеотидное разрешение. Проблема решается либо путем улучшения технологии записи, либо путем управления скоростью цепи ДНК с помощью различных стратегий белковой инженерии, и Oxford Nanopore использует «кмерский подход», анализируя более одной базы одновременно, так что что участки ДНК подлежат повторному исследованию, когда нить движется через нанопору по одному основанию за раз. Различные методы, в том числе алгоритмические, использовались для повышения производительности технологии MinION с тех пор, как она впервые стала доступной для пользователей. Совсем недавно были продемонстрированы эффекты отдельных оснований из-за вторичной структуры или высвобожденных мононуклеотидов.
Профессор Хаган Бейли в 2010 году предположил, что создание двух сайтов узнавания в альфа-гемолизине поры могут давать преимущества в распознавании оснований.
Одной из проблем «экзонуклеазного подхода», когда процессивный фермент вводит отдельные основания в правильном порядке в нанопоры, является интеграция экзонуклеазы и обнаружения нанопор. системы. В частности, проблема заключается в том, что когда экзонуклеаза гидролизует фосфодиэфирные связи между нуклеотидами в ДНК, не обязательно гарантируется, что впоследствии высвободившийся нуклеотид непосредственно переместится, скажем, в ближайшую нанопору альфа-гемолизина. Одна из идей состоит в том, чтобы прикрепить экзонуклеазу к нанопоре, возможно, посредством биотинилирования с бета-цилиндром гемолизином. Центральная пора белка может быть выстлана заряженными остатками, расположенными так, что положительный и отрицательный заряды появляются на противоположных сторонах поры. Однако этот механизм в первую очередь дискриминационный и не является механизмом, направляющим нуклеотиды по какому-то определенному пути.
