Мегануклеазы - это эндодезоксирибонуклеазы, характеризующиеся большим сайтом узнавания (двухцепочечные последовательности ДНК от 12 до 40 пар оснований); в результате этот сайт обычно встречается только один раз в любом данном геноме. Например, последовательность из 18 пар оснований, распознаваемая мегануклеазой I-SceI, в среднем потребовала бы случайного обнаружения генома в двадцать раз больше человеческого генома (хотя последовательности с одним несоответствием встречаются примерно три раза на человека- размерный геном). Поэтому мегануклеазы считаются наиболее специфическими ферментами рестрикции, встречающимися в природе.
Среди мегануклеаз семейство самонаводящихся эндонуклеаз LAGLIDADG стало ценным инструментом для изучения геномов и геномной инженерии за последние пятнадцать лет. Мегануклеазы - это « ножницы для молекулярной ДНК », которые можно использовать для точной замены, устранения или модификации последовательностей. Изменяя их последовательность распознавания с помощью белковой инженерии, можно изменить целевую последовательность. Мегануклеазы используются для модификации всех типов генома, будь то бактериальный, растительный или животный. Они открывают широкие возможности для инноваций, особенно в области здоровья человека, например, устранение вирусного генетического материала или «восстановление» поврежденных генов с помощью генной терапии.
Мегануклеазы обнаружены у большого количества организмов - архей или архебактерий, бактерий, фагов, грибов, дрожжей, водорослей и некоторых растений. Они могут экспрессироваться в разных компартментах клетки - ядре, митохондриях или хлоропластах. Идентифицировано несколько сотен таких ферментов.
Мегануклеазы в основном представлены двумя основными семействами ферментов, вместе известными как эндонуклеазы самонаведения: эндонуклеазами интронов и эндонуклеазами интеина.
В природе эти белки кодируются мобильными генетическими элементами, интронами или интеинами. Интроны распространяются путем вмешательства в точном месте в ДНК, где экспрессия meganuclease производит перерыв в комплементарной intron- или интеин-свободный аллель. Для интеинов и интронов группы I этот разрыв приводит к дупликации интрона или интеина на участке разрезания посредством гомологичной рекомбинации репарации разрывов двухцепочечной ДНК.
Мы относительно мало знаем о реальном назначении мегануклеаз. Широко распространено мнение, что генетический материал, кодирующий мегануклеазы, функционирует как паразитический элемент, который использует механизмы репарации клеток двухцепочечной ДНК в своих интересах как средство размножения и распространения, не повреждая генетический материал своего хозяина.
Существует пять семейств или классов самонаводящихся эндонуклеаз. Самым распространенным и известным является семейство LAGLIDADG. Эндонуклеазы семейства LAGLIDADG в основном обнаруживаются в митохондриях и хлоропластах эукариотических одноклеточных организмов.
Название этого семейства соответствует аминокислотной последовательности (или мотиву), которая более или менее консервативна во всех белках этого семейства. Эти небольшие белки также известны своими компактными и плотно упакованными трехмерными структурами.
К наиболее хорошо охарактеризованным эндонуклеазам, которые наиболее широко используются в исследованиях и геномной инженерии, относятся I-SceI (обнаружен в митохондриях пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae), I-CreI (из хлоропластов зеленых водорослей Chlamydomonas reinhardtii) и I-DmoI (из архебактерии Desulfurococcus mobilis).
Наиболее известными эндонуклеазами LAGLIDADG являются гомодимеры (например, I-CreI, состоящий из двух копий одного и того же белкового домена) или внутренне симметричные мономеры (I-SceI). Сайт связывания ДНК, содержащий каталитический домен, состоит из двух частей по обе стороны от точки разреза. Сайты полусвязывания могут быть очень похожими и связываться с палиндромной или полупалиндромной последовательностью ДНК (I-CreI), или они могут быть непалиндромными (I-SceI).
Высокая специфичность мегануклеаз придает им высокую точность и гораздо более низкую клеточную токсичность, чем другие природные рестрикционные ферменты. Мегануклеазы были идентифицированы в 1990-х годах, и последующая работа показала, что они являются особенно многообещающими инструментами для геномной инженерии и редактирования генов, поскольку они способны эффективно индуцировать гомологичную рекомбинацию, генерировать мутации и изменять рамки считывания.
Однако генетические рекомбинации, индуцированные мегануклеазами, которые могли быть выполнены, были ограничены набором доступных мегануклеаз. Несмотря на существование в природе сотен мегануклеаз и тот факт, что каждая из них способна переносить незначительные вариации в своем сайте узнавания, вероятность обнаружения мегануклеазы, способной разрезать данный ген в желаемом месте, чрезвычайно мала. Несколько групп обратили свое внимание на разработку новых мегануклеаз, которые будут нацелены на желаемые сайты узнавания.
Самые передовые исследования и приложения касаются самонаводящихся эндонуклеаз из семейства LAGLIDADG.
Для создания специально созданных мегануклеаз были приняты два основных подхода:
Эти два подхода можно комбинировать для увеличения возможности создания новых ферментов при сохранении высокой степени эффективности и специфичности. Ученые из Cellectis работают над редактированием генов с 1999 года и разработали коллекцию из более чем 20 000 белковых доменов из гомодимерной мегануклеазы I-CreI, а также из каркасов других мегануклеаз. Их можно комбинировать с образованием функциональных химерных гетеродимеров, созданных на заказ для исследовательских лабораторий и промышленных целей.
Precision Biosciences, еще одна биотехнологическая компания, разработала полностью рациональный процесс проектирования под названием «Редактор направленных нуклеаз» (DNE), который позволяет создавать сконструированные мегануклеазы, нацеленные на определенное пользователем место в геноме и изменяющие его. В 2012 году исследователи из Bayer CropScience использовали DNE для включения последовательности гена в ДНК растений хлопка, направляя ее точно в заданный участок.
Одним из недавних достижений в использовании мегануклеаз для геномной инженерии является включение ДНК-связывающего домена эффекторов, подобных активатору транскрипции (TAL), в гибридные нуклеазы. Эти «мегаталлы» сочетают в себе простоту конструирования и высокую специфичность связывания ДНК эффектора TAL с высокой эффективностью расщепления мегануклеаз. Кроме того, мегануклеазы были слиты с ферментами, обрабатывающими концы ДНК, чтобы способствовать склонному к ошибкам негомологичному соединению концов и увеличить частоту мутагенных событий в данном локусе.
Как указано в первом абзаце, мегануклеаза с последовательностью из 18 пар оснований в среднем потребует, чтобы геном в двадцать раз превышал размер человеческого генома, чтобы быть обнаруженным один раз случайно; расчет 4 18 / 3x10 9 = 22,9. Однако гораздо чаще встречаются очень похожие последовательности, и чем быстрее увеличивается частота, тем больше несовпадений допускается.
Например, последовательность, которая идентична для всех, кроме одной пары оснований, могла бы случайно встречаться в среднем каждые 4 17 / 18x3x10 9 = 0,32 эквивалента генома человека или трижды на геном человека. Последовательность, которая идентична во всех парах оснований, кроме двух, в среднем встречается случайно один раз каждые 4 16 / (18C2) x3x10 9 = 0,0094 эквивалента генома человека, или 107 раз на геном человека.
Это важно, потому что у ферментов нет идеального различения; нуклеаза все еще будет иметь некоторую вероятность действовать, даже если последовательность не совпадает с точностью. Таким образом, активность нуклеазы в последовательности с одним несовпадением меньше, чем в случае отсутствия несовпадений, а активность еще меньше для двух несовпадений, но все же не равна нулю. Исключение этих последовательностей, которые очень похожи, но не идентичны, все еще является важной проблемой, которую необходимо преодолеть в геномной инженерии.
Метилирование ДНК и структура хроматина влияют на эффективность переваривания мегануклеаз. Поэтому для практического применения этих ферментов необходимо тщательное рассмотрение генетического и эпигенетического контекста последовательности-мишени.
В декабре 2014 года ВПТЗ США выдало патент 8921332, касающийся редактирования генома на основе мегануклеаз in vitro. Лицензия на этот патент была выдана исключительно компании Cellectis.