Войти
Механизм сплайсинга белков с участием интеинов. На этой схеме N-extein показан красным, интеин - черным, а C-extein - синим. X представляет собой атом кислорода или серы. Сплайсинг белков - это внутримолекулярная реакция определенного белка, в которой внутренний белковый сегмент (называемый интеином) удаляется из белка-предшественника с лигированием C-концевых и N-концевых внешних белков (называемых экстеинами ) с обеих сторон. Соединение сплайсинга белка-предшественника в основном представляет собой цистеин или серин, которые представляют собой аминокислоты, содержащие нуклеофильную боковую цепь. Известные в настоящее время реакции сплайсинга белков не требуют экзогенных кофакторов или источников энергии, таких как аденозинтрифосфат (АТФ) или гуанозинтрифосфат (ГТФ). Обычно сплайсинг связан только со сплайсингом пре-мРНК. Этот белок-предшественник содержит три сегмента - N-экстеин, за которым следует интеин, за которым следует C-экстеин. После сплайсинга полученный белок содержит N-extein, связанный с C-extein; этот сращивающий продукт также называют экстейном.
Первый интеин был открыт в 1988 году путем сравнения последовательностей между Neurospora crassa и морковной вакуолярной АТФазой (без интеина) и гомологичным геном дрожжей (с интеином), который был впервые описан как предполагаемый переносчик ионов кальция. В 1990 году Хирата и др. продемонстрировали, что дополнительная последовательность дрожжевого гена транскрибируется в мРНК и удаляется из белка-хозяина только после трансляции. С тех пор интеины были обнаружены во всех трех сферах жизни (эукариоты, бактерии и археи) и в вирусах.
Сплайсинг белков был неожиданным, и его механизмы были обнаружены двумя группами (Anraku и Stevens) в 1990 году. Они обе обнаружили Saccharomyces cerevisiae VMA1 в предшественнике вакуолярного фермента H + - ATPase. Аминокислотная последовательность N- и C-концов соответствовала 70% последовательности ДНК вакуолярной Н + -АТФазы других организмов, в то время как аминокислотная последовательность центрального положения соответствовала 30% общей последовательности ДНК дрожжи HO нуклеазы.
Многие гены имеют неродственные кодирующие интеин сегменты, вставленные в разные положения. По этим и другим причинам интеины (или, точнее, сегменты гена, кодирующие интеины) иногда называют эгоистичными генетическими элементами, но, возможно, правильнее было бы назвать их паразитическими. Согласно геноцентричному взгляду на эволюцию, большинство генов «эгоистичны» лишь постольку, поскольку они конкурируют с другими генами или аллелями, но обычно они выполняют функцию для организмов, тогда как «паразитические генетические элементы», по крайней мере на начальном этапе, не создают положительный вклад в физическую форму организма.
В базе данных всех известных интеинов ( [1] ) 113 известных интеинов присутствуют в эукариотах с минимальной длиной 138 аминокислот и максимальной длиной 844 аминокислоты. Был обнаружен первый интеин, кодируемый геном VMA Saccharomyces cerevisiae. Позже они были обнаружены в грибах (аскомицеты, базидиомицеты, зигомицеты и хитриды), а также в различных белках. Было описано, что белок, отдаленно связанный с известными интеинами, содержащими белок, но тесно связанный с белками многоклеточных животных hedgehog, имеет последовательность интеина из Glomeromycota. Многие из недавно описанных интеинов содержат самонаводящиеся эндонуклеазы, и некоторые из них, по-видимому, активны. Обилие интеина в грибах указывает на латеральный перенос генов, содержащих интеин. В то время как у эубактерий и архей в настоящее время известно 289 и 182 интеина. Неудивительно, что большая часть интеина у эубактерий и архей, как и у грибов, встроена в метаболический белок нуклеиновых кислот.
Процесс начинается со сдвига NO или NS, когда боковая цепь первого остатка ( серин, треонин или цистеин ) интеиновой части белка-предшественника нуклеофильно атакует пептидную связь остатка непосредственно перед ним (то есть конечный остаток N-extein) с образованием промежуточного линейного сложного эфира (или сложного тиоэфира ). Переэтерификации происходит тогда, когда боковая цепь первого остатка атак C-extein вновь образованной (тио) эфира, чтобы освободить N-концевой конец интеина. Это образует разветвленный интермедиат, в котором N-extein и C-extein присоединены, хотя и не через пептидную связь. Последний остаток интеина всегда представляет собой аспарагин, а атом азота амида этой боковой цепи расщепляет пептидную связь между интеином и С-экстеином, в результате чего образуется свободный сегмент интеина с концевым циклическим имидом. Наконец, свободная аминогруппа C-extein теперь атакует (тио) сложный эфир, связывая N- и C-exteins вместе. Сдвиг ON или SN приводит к образованию пептидной связи и функционального лигированного белка.
Механизм эффекта сплайсинга - это естественная аналогия метода химического создания белков среднего размера, называемого нативным химическим лигированием.
Интеин представляет собой сегмент белка, который способен вырезань себя и присоединиться к оставшимся частям (в exteins) с пептидной связью в ходе белкового сплайсинга. Интеины также называют интронами белков по аналогии с интронами (РНК).
Первая часть имени интеина основана на научном название этого организма, в котором она находится, а вторая часть основана на имя соответствующего гена или extein. Например, интеин, обнаруженный в Thermoplasma acidophilum и связанный с субъединицей A вакуолярной АТФазы (VMA), называется «Tac VMA».
Обычно, как в этом примере, достаточно всего трех букв, чтобы указать организм, но есть варианты. Например, для обозначения напряжения могут быть добавлены дополнительные буквы. Если в соответствующем гене кодируется более одного интеина, интеинам дается числовой суффикс, начинающийся с 5 'до 3', или в порядке их идентификации (например, «Msm dnaB-1»).
Сегменту гена, который кодирует интеин, обычно дается то же имя, что и интеин, но во избежание путаницы название собственно интеина обычно пишется с большой буквы ( например, Pfu RIR1-1), тогда как имя соответствующего сегмента гена курсивом ( например, Pfu rir1-1).
Типы белков сплайсинга подразделяются на четыре класса: макси-интеин, мини-интеин, интеин транс-сплайсинга и интеин аланина. Макси-интеины представляют собой N- и C-концевые домены сплайсинга, содержащие эндонуклеазный домен. Мини-интеины представляют собой типичные N- и C-концевые домены сплайсинга; однако эндонуклеазный домен отсутствует. При транс-сплайсинге интеинов интеин расщепляется на два (или, возможно, более) домена, которые затем делятся на N-конец и C-конец. Интеины аланина имеют сплайсинговое соединение аланина вместо цистеина или серина, в обоих из которых происходит сплайсинг белка.
Интеины могут содержать домен самонаводящегося гена эндонуклеазы (HEG) в дополнение к доменам сплайсинга. Этот домен отвечает за распространение интеина путем расщепления ДНК на свободном от интеина аллеле на гомологичной хромосоме, запуская систему репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSBR), которая затем восстанавливает разрыв, таким образом копируя ДНК, кодирующую интеин. на сайт, ранее не содержавший интеина. Домен HEG не является необходимым для интеина сплайсинга, и поэтому он может быть потерян, образуя минимальную или мини, интеин. Несколько исследований продемонстрировали модульную природу интеинов путем добавления или удаления доменов HEG и определения активности новой конструкции.
Иногда интеин белка-предшественника происходит от двух генов. В этом случае интеин называется расщепленным интеином. Например, в цианобактерии, DnaE, каталитическая субъединица α из ДНК - полимеразы III, кодируется двумя отдельными генами, dnaE-н и dnaE-с. DnaE-н продукт состоит из N-extein последовательности с последующим 123-AA интеина последовательности, в то время как dnaE-с Продукт состоит из 36-AA интеина последовательности с последующим C-extein последовательности.
Интеины очень эффективны при сплайсинге белков, и, соответственно, они нашли важную роль в биотехнологии. На сегодняшний день идентифицировано более 200 интеинов; размеры варьируются от 100 до 800 AA. Интеины были разработаны для конкретных приложений, таких как полусинтез белков и селективное мечение белковых сегментов, что полезно для ЯМР- исследований больших белков.
Фармацевтическое ингибирование удаления интеина может быть полезным инструментом для разработки лекарств ; белок, содержащий интеин, не будет выполнять свою нормальную функцию, если интеин не вырезан, поскольку его структура будет нарушена.
Было высказано предположение, что интеины могут оказаться полезными для достижения аллотопной экспрессии некоторых высокогидрофобных белков, обычно кодируемых митохондриальным геномом, например, в генной терапии. Гидрофобность этих белков препятствует их импорту в митохондрии. Следовательно, вставка негидрофобного интеина может позволить этому импорту продолжаться. Вырезание интеина после импорта восстановит белок до дикого типа.
Аффинные метки широко используются для очистки рекомбинантных белков, поскольку они позволяют накапливать рекомбинантный белок с небольшими примесями. Однако аффинная метка должна быть удалена протеазами на последней стадии очистки. Этап дополнительного протеолиза поднимает проблемы специфичности протеазы при удалении аффинных меток из рекомбинантного белка и удалении продукта переваривания. Этой проблемы можно избежать путем слияния аффинной метки с саморасщепляемыми интеинами в контролируемой среде. В первом поколении экспрессионных векторов такого типа использовался модифицированный интеин Saccharomyces cerevisiae VMA (Sce VMA). Чонг и др. использовали хитинсвязывающий домен (CBD) из Bacillus circans в качестве аффинной метки и слили эту метку с модифицированным интеином Sce VMA. Модифицированный интеин подвергается реакции самоотщепления по его N-концевой пептидной связи с 1,4-дитиотреитолом (DTT), β-меркаптоэтанолом (β-ME) или цистином при низких температурах в широком диапазоне pH. После экспрессии рекомбинантного белка гомогенат клеток пропускают через колонку, содержащую хитин. Это позволяет CBD химерного белка связываться с колонкой. Кроме того, когда температура понижается и описанные выше молекулы проходят через колонку, химерный белок подвергается самосплайсингу, и только целевой белок элюируется. Этот новый метод устраняет необходимость в стадии протеолиза, и модифицированный Sce VMA остается в колонке, прикрепленной к хитину через CBD.
Недавно интеины использовались для очистки белков на основе самоагрегированных пептидов. Эластиноподобные полипептиды (ELP) - полезный инструмент в биотехнологии. Слитые с белком-мишенью, они имеют тенденцию образовывать агрегаты внутри клеток. Это исключает необходимость хроматографической очистки белка. Теги ELP использовались в слитном белке интеина, так что агрегаты могут быть выделены без хроматографии (центрифугированием), а затем интеин и метка могут быть расщеплены контролируемым образом для высвобождения целевого белка в раствор. Это выделение белка может быть выполнено с использованием непрерывного потока среды, что дает большое количество белка, что делает этот процесс более экономичным, чем обычные методы. Другая группа исследователей использовала более мелкие самоагрегированные метки для выделения целевого белка. Небольшие амфипатические пептиды 18A и ELK16 (фиг. 5) использовали для образования саморасщепляющегося агрегирующего белка.
