Войти
Иммуномика - это исследование регуляции иммунной системы и реакции на патогены с использованием общегеномные подходы. С развитием геномных и протеомных технологий, ученые смогли визуализировать биологические сети и сделать выводы о взаимосвязях между генами и / или белками; недавно эти технологии стали использоваться, чтобы лучше понять, как функционирует иммунная система и как она регулируется. Две трети генома активны в одном или нескольких типах иммунных клеток, и менее 1% генов однозначно экспрессируются в данном типе клеток. Следовательно, критически важно, чтобы паттерны экспрессии этих типов иммунных клеток были расшифрованы в контексте сети, а не как индивидуума, чтобы их роли были правильно охарактеризованы и соотнесены друг с другом. Дефекты иммунной системы, такие как аутоиммунные заболевания, иммунодефицит и злокачественные новообразования, могут получить пользу от геномного понимания патологических процессов. Например, анализ систематических вариаций экспрессии генов может связать эти паттерны с конкретными заболеваниями и генными сетями, важными для иммунных функций.
Традиционно ученым, изучающим иммунную систему, приходилось искать антигены на индивидуальной основе и идентифицировать белковые последовательности этих антигенов («эпитопы »), которые будут стимулировать иммунный ответ. Эта процедура требовала, чтобы антигены были выделены из целых клеток, переварены на более мелкие фрагменты и протестированы против Т- и В-клеток, чтобы наблюдать ответы Т- и В-клеток. Эти классические подходы могли визуализировать эту систему только как статическое состояние и требовали большого количества времени и труда.
Иммуномика упростила этот подход благодаря своей способности рассматривать иммунную систему в целом и характеризовать ее как динамическую модель. Выяснилось, что одними из наиболее отличительных черт иммунной системы являются непрерывная подвижность, обновление и пластичность составляющих ее клеток. Кроме того, современные геномные технологии, такие как микрочипы, могут фиксировать экспрессию генов иммунной системы с течением времени и могут отслеживать взаимодействия микроорганизмов с клетками врожденной иммунной системы. Новые протеомные подходы, включая картирование эпитопа Т-клеток и В-клеток , также могут ускорить темпы, с которыми ученые обнаруживают взаимосвязь антитело-антиген.
Иммунная система хозяина реагирует на вторжение патогена набором патоген-специфических реакций, в которых участвует множество «игроков»; к ним относятся антитела, Т-хелперные клетки, цитотоксические Т-клетки и многие другие. Антигенпрезентирующие клетки (APC) способны интернализовать патогены и отображать фрагмент антигена - эпитоп - с основными комплексами гистосовместимости (MHCs) на клеточная поверхность. Т-клеточный ответ инициируется, когда Т-клетки распознают эти отображаемые эпитопы. Только специфические пептидные последовательности некоторых патоген-специфических антигенов необходимы для стимуляции Т- и В-клеточных ответов; то есть вся последовательность патогенного пептида не является необходимой для инициирования иммунного ответа. «Иммуном » патогена описывается набором его эпитопов и может быть определен путем сравнения последовательностей генома и применения иммуноинформатических инструментов.
et al. были одними из первых, кто распознал потенциал кДНК микрочипов для определения экспрессии генов иммунных клеток. Их анализ исследовал экспрессию генов В- и Т лимфоцитов человека во время клеточной активации и / или стимуляции цитокинами, типом сигнальной регуляторной молекулы. Известно, что многие из активированных генов в стимулированных Т-лимфоцитах участвуют в переходе G0 / G1 клеточного цикла или кодируют хемокины, сигнальные молекулы, участвующие в воспалительной реакции. Эта команда также смогла визуализировать временные паттерны экспрессии генов во время митогенеза Т-клеток . В заключительных абзацах своей знаменательной статьи эти ученые заявляют, что «практически каждый уголок иммунологических исследований выиграет от анализа экспрессии генов с помощью микроматрицы кДНК», и, таким образом, возвестили рост иммуномики.
Ограниченные доступными микрочипами и неполным геномом человека на данный момент, эта же группа исследователей была мотивирована на создание специализированного микроматрицы, которая фокусировалась на генах, преимущественно экспрессируемых в данном типе клеток или известных быть функционально важным в данном биологическом процессе. В результате Ализаде и его коллеги разработали микроматрицу кДНК «Лимфочип», которая содержала 13000 генов и была обогащена генами, важными для иммунной системы.
Iyer et al., 1999 Статья была еще одной, чтобы показать важность применения геномных технологий в иммунологических исследованиях. Несмотря на то, что в начале своего эксперимента не собирались затрагивать какие-либо аспекты иммунитета, эти исследователи обнаружили, что профили экспрессии стимулированных сывороткой фибробластов были намного богаче, чем предполагалось, и предположили, что это важный физиологический фактор. роль фибробластов в заживлении ран. Гены, индуцированные сывороткой, были связаны с процессами, относящимися к заживлению ран, включая гены, непосредственно участвующие в ремоделировании сгустка и внеклеточного матрикса, а также гены, кодирующие сигнальные белки для воспаления, развития новых кровеносных сосудов и возобновления роста эпителиальной ткани. Кроме того, одним из наиболее значимых результатов этого анализа экспрессии было открытие более 200 ранее неизвестных генов, экспрессия которых регулировалась во времени во время реакции фибробластов на сыворотку. Эти результаты показали важность рассмотрения иммунного ответа как совместной физиологической программы и потребовали дальнейшего изучения иммунной системы как сети, а не только как отдельных частей.
В 2006 г. Moutaftsi et al. продемонстрировали, что инструменты картирования эпитопов могут точно идентифицировать эпитопы, ответственные за 95% ответа мышиных Т-клеток на вирус осповакцины. Благодаря своей работе эти ученые представили междисциплинарную область информатики и иммунологии, используя геномные, протеомные и иммунологические данные. Поразительный успех и простота этого метода побудили исследователей как определить иммуномы других патогенов, так и измерить широту и перекрытие иммуномов патогенов, которые вызывают иммунитет. Кроме того, он предложил другие приложения, в которых можно было бы использовать инструменты картирования эпитопов, включая аутоиммунитет, трансплантацию и иммуногенность.
Было применено несколько типов микрочипов создан специально для наблюдения за реакцией и взаимодействием иммунной системы. В микрочипах антител антитела используются в качестве зондов, а антигены - в качестве мишеней. Их можно использовать для прямого измерения концентраций антигенов, для которых специфичны зонды антител. Пептидные микрочипы используют пептиды антигенов в качестве зондов и сывороточные антитела в качестве мишеней. Их можно использовать для функциональных иммуномических применений для понимания аутоиммунных заболеваний и аллергий, определения эпитопов B-клеток, исследований вакцин, анализов обнаружения и анализа специфичности антител. Микроматрицы MHC являются самой последней разработкой в иммуномных массивах и используют комплексы пептид-MHC и их костимулирующие молекулы в качестве зондов, а популяции Т-клеток в качестве мишеней. Связанные Т-клетки активируются и секретируют цитокины, которые захватываются специфическими детектирующими антителами. Этот микрочип может картировать Т-клеточные эпитопы, ограниченные МНС.
The Lymphochip: Special cDNA microarray Lymphochip - это специализированный микрочип кДНК человека, обогащенный генами, связанными с иммунной функцией, и созданный с помощью Стэнфордский университет. 17 853 клонов кДНК были взяты из трех источников. Первый набор клонов был выбран, если идентифицированные теги экспрессируемой последовательности (EST) были уникальными или специфически обогащенными библиотеками лимфоидной кДНК; они составляют ~ 80% клонов лимфочипа. Второй набор клонов был идентифицирован во время анализа иммунных ответов на микрочипах первого поколения. Наконец, 3183 гена, о которых известно или предполагается, что они играют роль в иммунной функции, онкогенезе, апоптозе, пролиферации клеток или являются открытыми рамками считывания патогенных вирусов человека. использовались на лимфочипе. Часто добавляются новые гены.
Картирование эпитопов идентифицирует сайты антител, с которыми связываются их целевые антигены. В прошлом ученым приходилось выделять антигены, переваривать их на более мелкие фрагменты и определять, какие из этих фрагментов стимулировали ответы Т- и В-клеток, чтобы определить эпитоп антитела. Иммуномика использует возможности биоинформатики и предлагает алгоритмы картирования, которые ускоряют обнаружение последовательностей эпитопов. Эти алгоритмы актуальны для разработки вакцины, а также для характеристики и модификации иммунных ответов в контексте аутоиммунитета, эндокринологии, аллергии, трансплантации, диагностики и разработки терапевтических белков..
Алгоритмы картирования эпитопов Т-клеток и В-клеток могут предсказывать эпитопы с помощью вычислений на основе геномной последовательности патогенов без предварительного знания структуры или функции белка. Для идентификации эпитопов используется серия шагов:
Руководящий принцип проточной цитометрии заключается в том, что клетки или субклеточные частицы, помеченные флуоресцентными зондами, проходят через лазерный луч и сортируются по силе флуоресценции, излучаемой клетками, содержащимися в каплях. MHC [[окрашивание тетрамера]] с помощью проточной цитометрии идентифицирует и изолирует специфические Т-клетки на основе специфичности связывания их рецепторов на клеточной поверхности с флуоресцентно-меченными комплексами MHC-пептид.
ELISPOT модифицированная версия иммуноанализа ELISA и является распространенным методом мониторинга иммунных ответов.
Иммуномика оказала значительное влияние на понимание иммунной системы, выявляя различия в профилях экспрессии генов разных типов клеток, характеризуя иммунный ответ, освещая клоны иммунных клеток отношения и создание сетей регуляции генов. Несмотря на то, что следующий список статей не является полным, он предназначен для демонстрации широкого применения иммуномических исследований и сильных последствий для иммунологии.
Микромассивы обнаружили паттерны экспрессии генов, которые коррелируют с индуцированной антигеном активацией или анергией в B-лимфоцитах. Пути анергии лимфоцитов включают индукцию некоторых, но не всех сигнальных путей, используемых во время активации лимфоцитов. Например, пути NFAT и MAPK / ERK киназы экспрессируются в анергических (или «толерантных») клеточных линиях, тогда как NF-kB и c- Пути Jun N-концевых киназ - нет. Из 300 генов, экспрессия которых была изменена после стимуляции антигеном наивных В-клеток, только 8 из этих генов регулировались в толерантных В-клетках. Понимание этих путей «толерантности» имеет важное значение для разработки иммуносупрессивных препаратов. Эти сигнатуры экспрессии генов толерантных В-клеток можно использовать во время скрининга лекарств для исследования соединений, которые имитируют функциональные эффекты естественной толерантности.
Профили экспрессии генов во время лимфоцитов человека дифференцировка следовала за зрелыми, наивными В-клетками из состояния покоя через реакции зародышевого центра и в терминальную дифференцировку. Эти исследования показали, что В-клетки зародышевого центра представляют собой отдельную стадию дифференцировки, поскольку профиль экспрессии генов отличается от активированных периферических В-клеток. Хотя ни одна система культивирования in vitro не смогла побудить покоящиеся периферические В-клетки принять полный фенотип зародышевого центра, эти профили экспрессии генов можно использовать для измерения успеха культур in vitro в имитации состояния зародышевого центра по мере их развития.
Около 9 из каждых 10 лимфоидных опухолей человека происходят от В-клеток. Отчетливые паттерны экспрессии в масштабе всего иммунома в большом количестве диффузных крупноклеточных лимфом (DLCL) - наиболее распространенной формы неходжкинской лимфомы - выявили по крайней мере два разных подтипа того, что ранее считалось одиночное заболевание. Одна подгруппа этих DLCL демонстрирует паттерн экспрессии генов, подобный таковому у нормальных В-клеток зародышевого центра, и подразумевает, что опухолевая клетка произошла из В-клетки зародышевого центра. Другие исследования В-клеточных злокачественных новообразований показывают, что фолликулярные лимфомы имеют общие черты экспрессии с В-клетками зародышевого центра, тогда как клетки хронического лимфоцитарного лейкоза напоминают покоящиеся лимфоциты периферической крови. Кроме того, гетерогенность в каждой из этих клеточных линий также предполагает, что разные подтипы существуют в пределах каждого типа лимфомы, как это было показано в DLCL. Эти знания могут быть использованы для направления пациентов к наиболее подходящей терапии.
Микроматрицы проанализировали общие ответы макрофагов к различным микроорганизмам и подтвердили, что эти реакции поддерживают и контролируют воспалительные процессы, а также убивают микроорганизмы. Эти независимые исследования смогли лучше описать, как макрофаги атакуют различные микроорганизмы. Было обнаружено, что «основной транскрипционный ответ» индуцирует 132 гена и подавляет 59 генов. Индуцированные гены включают провоспалительные хемокины и цитокины и их соответствующие рецепторы. Также наблюдали «патоген-специфический ответ».
Дендритные клетки (DC) помогают макрофагам поддерживать воспалительные процессы и участвовать в врожденной иммунной системе ответ, но может также активировать адаптивный иммунитет. Анализ экспрессии генов показал, что DC могут «выполнять несколько задач», временно разделяя их различные функции. Вскоре после распознавания инфекционного агента незрелые ДК переходят в состояние ранней активации через основной ответ, характеризующийся быстрым подавлением генов, участвующих в распознавании патогенов и фагоцитозом, активацией генов цитокинов и хемокинов для рекрутирования других иммунных клеток в сторону воспалений; и экспрессия генов, контролирующих миграционную способность. Ранние активированные DC могут мигрировать из нелимфоидных тканей в лимфатические узлы, где они могут запускать Т-клеточные ответы. Эти ранние ответы DC связаны с врожденным иммунитетом и состоят из «основного транскрипционного ответа» DC. Патоген-специфические ответы сильнее влияют на способность ДК регулировать адаптивный иммунитет.
Сравнение различий между общей программой транскрипции иммунных клеток может создать графики, которые позиционируют каждый тип клеток таким образом, чтобы наилучшим образом отражать его профиль экспрессии относительно всех других клеток, и могут выявить интересные взаимосвязи между типы клеток. Например, профили транскрипции иммунных клеток медуллярного эпителия тимуса картированы ближе к лимфоцитам, чем к другому эпителию. Это может означать, что между этими двумя типами клеток существует функциональное взаимодействие, которое требует совместного использования определенных транскриптов и белков. При сравнении профилей экспрессии генов из клеток системы крови, субпопуляции Т-клеток и В-клеток тесно группируются с соответствующими типами клеток.
Изучая профиль транскрипции различных Т-клеток, ученые показали, что естественные Т-клетки-киллеры являются близким вариантом обычных CD4 + Т-клеток, а не клетками промежуточного типа. между Т-клетками и естественными клетками-киллерами. Кроме того, DC, естественные клетки-киллеры и B-клетки плотно сгруппированы на основе их глобальных профилей экспрессии. Можно было ожидать, что В-лимфоциты и Т-лимфоциты будут кластеризоваться отдельно друг от друга, или что естественные клетки-киллеры будут более тесно связаны с Т-клетками, потому что они имеют общие предшественники, цитолитическую активность и аналогичные маркеры активации. Таким образом, иммуномика установила отношения между клеточными линиями, которые отличаются от классических взглядов. Кроме того, это может лучше объяснить наблюдаемую пластичность дифференцировки лимфоидных и миелоидных клеток из-за значительного перекрытия между глобальными профилями экспрессии этих разных клонов.
Сети представляют самый широкий уровень генетических взаимодействий и стремятся связать все гены и транскрипты в иммунологическом геноме. Клеточные фенотипы и состояния дифференцировки в конечном итоге устанавливаются активностью этих сетей совместно регулируемых генов. Одна из наиболее полных сетей в иммунологии расшифровала регуляторные связи между нормальными и трансформированными В-клетками человека. Этот анализ предполагает наличие иерархической сети, в которой небольшое количество тесно связанных генов (называемых «концентраторами») регулирует большинство взаимодействий. Прото- онкоген MYC возник как главный узел и очень влиятельный регулятор В-клеток. Примечательно, что MYC, как было обнаружено, непосредственно контролирует BYSL, высококонсервативный, но плохо охарактеризованный ген, и является крупнейшим центром во всей сети B-клеток. Это говорит о том, что BYSL кодирует важную клеточную молекулу и критический фактор, влияющий на функцию MYC, и мотивирует дополнительные исследования для выяснения его функции. Следовательно, использование данных об экспрессии генов для создания сетей может выявить гены, сильно влияющие на дифференцировку иммунных клеток, которые еще не были идентифицированы прегеномными технологиями.
Как цитируют Стефания Бамбини и Рино Раппуоли: «Новые мощные технологии геномики увеличили количество болезней, которые можно лечить с помощью вакцинации, и сократили время для открытия исследований и разработки вакцины ». Доступность полных последовательностей генома патогенов в сочетании с высокопроизводительными геномными технологиями помогли ускорить разработку вакцины. В обратной вакцинологии используются геномные последовательности вирусных, бактериальных или паразитарных патогенов для идентификации генов, потенциально кодирующих гены, которые способствуют патогенезу. Первое применение обратной вакцинологии идентифицировало вакцины-кандидаты против Neisseria meningitidis серогруппы B. Вычислительные инструменты идентифицировали 600 предполагаемых поверхностно-экспонированных или секретируемых белков из полной последовательности генома патогенного штамма MenB на основе особенностей последовательности. Эти предполагаемые белки были экспрессированы в E. coli, очищены и использованы для иммунизации мышей. Тесты с использованием иммунных сывороток мышей оценили способность антител защищать от этих белков. Белки, способные вызывать устойчивый иммунный ответ, были проверены на сохранение последовательности в группе штаммов менингитов и позволили дополнительно выбрать антиген, способный вызывать иммунный ответ против большинства штаммов в панели. На основе этих последовательностей антигенов ученые смогли разработать универсальную «коктейльную» вакцину против Neisseria meninitidis, которая использует пять антигенов для повышения иммунитета. Подобные подходы использовались для множества других патогенов человека, таких как Streptococcus pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis, Porphyromonas gingivalis, Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori и другие. Кроме того, начались исследования по разработке вакцин против вирусов.
Перечень рецепторов и путей передачи сигналов, которые иммунные клетки используют для мониторинга и защиты организма, дает начало характерным паттернам измененной экспрессии генов в клетках периферической крови, которые отражают характер инфекция или травма. Следовательно, распознавание характерных профилей экспрессии клеток периферической крови может быть мощным диагностическим инструментом путем привлечения этих клеток в качестве «шпионов» для обнаружения скрытых заболеваний или агентов, которые нельзя легко культивировать от хозяина.
Например, инфекция цитомегаловирусом (CMV) фибробластов и инфекция HTLV-I Т-лимфоцитов выявили различные профили экспрессии генов. Инфекция ЦМВ вызывала уникальный ответ интерферона, тогда как инфекция HTLV-1 индуцировала гены-мишени NF-kB. Тип лейкоцитов также был протестирован снова на воздействие бактерий, и экспрессия иммунома варьировалась в зависимости от типа используемого бактериального штамма.
Мониторинг изменения экспрессии генов периферической крови также может помочь определить течение инфекции и помочь лечить пациентов терапией, адаптированной к стадии их заболевания. Этот подход уже использовался против сепсиса - болезни, которая развивается по предсказуемой цепочке событий. Изменения сигнатуры экспрессии генов могут предшествовать клиническому обострению симптомов, как в рассеянном склерозе, и позволяют врачам пресекать эти «вспышки» в зародыше.
Иммунная система - это сеть генетических и сигнальных путей, связанных сетью взаимодействующих клеток. Проект «Иммунологический геном» стремится создать полный перечень экспрессии генов, кодирующих белок, для всех популяций клеток иммунной системы мыши. Он анализирует как стационарные условия в различных популяциях клеток, так и в ответ на генетические и / или экологические нарушения, вызванные естественным генетическим полиморфизмом, нокаутом гена, нокаутом гена РНКи или лечением лекарствами. Вычислительные инструменты для обратного проектирования или прогнозирования регуляторных сетей иммунных клеток используют эти профили экспрессии.
К 2008 году в проекте ImmGen участвовали семь лабораторий иммунологии и три лаборатории вычислительной биологии в США, и было идентифицировано и описано более 200 популяций клеток, задействованных в иммунной системе. Этот консорциум создал браузер данных для исследования паттернов экспрессии определенных генов, сетей совместно регулируемых генов и генов, которые могут надежно различать типы клеток. Необработанные данные также доступны из NCBI's Gene Expression Omnibus.
←
