Войти
Просмотр с высоким содержанием (HCS), также известный как анализ высокого содержания (HCA) или целломика, - это метод, который используется в биологических исследованиях и открытии лекарств для идентифицировать вещества, такие как небольшие молекулы, пептиды или РНКи, которые изменяют фенотип клетки в желаемым способом. Следовательно, скрининг с высоким содержанием является типом фенотипического scr een проводится в ячейках, включающих анализ целых клеток или компонентов клеток с одновременным считыванием нескольких параметров. HCS относится к высокопроизводительному скринингу (HTS), при котором тысячи соединений тестируются параллельно на их активность в одном или нескольких биологических анализах, но включают в себя анализы более сложных клеточных фенотипов в качестве выходных данных. Фенотипические изменения могут включать увеличение или уменьшение продукции клеточных продуктов, таких как белки, и / или изменения морфологии (внешнего вида) клетки. Следовательно, HCA обычно включает автоматизированную микроскопию и анализ изображений. В отличие от анализа высокого контента, скрининг высокого контента подразумевает уровень пропускной способности, поэтому термин «скрининг» отличает HCS от HCA, который может быть высоким по содержанию, но низкой пропускной способностью.
При скрининге с высоким содержанием клетки сначала инкубируют с веществом, и через некоторое время анализируют структуры и молекулярные компоненты клеток. Наиболее распространенный анализ включает маркировку белков флуоресцентными метками, и, наконец, изменения в фенотипе клеток измеряются с помощью автоматического анализа изображений. Благодаря использованию флуоресцентных меток с разными максимумами поглощения и излучения можно параллельно измерять несколько различных компонентов ячейки. Кроме того, визуализация позволяет обнаруживать изменения на субклеточном уровне (например, цитоплазма по сравнению с ядром по сравнению с другими органеллами ). Следовательно, для каждой ячейки может быть собрано большое количество точек данных. Помимо флуоресцентного мечения, для скрининга высокого содержания использовались различные анализы без метки.
Одним из приложений HCS является обнаружение новых кандидатов в лекарства Скрининг с высоким содержанием ( HCS) в клеточных системах использует живые клетки в качестве инструментов в биологических исследованиях, чтобы выяснить, как работают нормальные и больные клетки. HCS также используется для обнаружения и оптимизации новых лекарственных препаратов. Высококачественный скрининг - это сочетание современной клеточной биологии со всеми ее молекулярными инструментами, автоматизированной микроскопии с высоким разрешением и роботизированной обработки. Клетки сначала подвергаются воздействию химикатов или реагентов РНКи. Затем изменения в морфологии клеток обнаруживаются с помощью анализа изображений. Изменения в количестве белков, синтезируемых клетками, измеряются с использованием различных методов, таких как зеленые флуоресцентные белки, слитые с эндогенными белками, или флуоресцентными антителами.
. Технология может использоваться для определения модифицирует ли заболевание потенциальное лекарство. Например, у человека рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), представляют собой большое семейство из около 880 белков клеточной поверхности, которые преобразуют внеклеточные изменения в окружающей среде в клеточный ответ, например, запускают повышение кровяного давления. из-за выброса регулирующего гормона в кровоток. Активация этих GPCR может включать их проникновение в клетки, и когда это можно визуализировать, это может быть основой систематического анализа функции рецепторов с помощью химической генетики, систематического геномного широкого скрининга или физиологического анализа. манипуляции.
На клеточном уровне параллельный сбор данных о различных свойствах клеток, например об активности каскадов передачи сигнала и целостности цитоскелета, является основным преимуществом этого метода в сравнение с более быстрым, но менее подробным скринингом с высокой пропускной способностью. Хотя HCS работает медленнее, множество собранных данных позволяет более глубоко понять эффекты лекарств.
Автоматический скрининг на основе изображений позволяет идентифицировать небольшие соединения, изменяющие клеточные фенотипы, и представляет интерес для открытия новых фармацевтических препаратов и новых биологических инструментов клетки для изменения функции клеток. Выбор молекул на основе клеточного фенотипа не требует предварительного знания биохимических мишеней, на которые воздействуют соединения. Однако идентификация биологической мишени значительно упростит последующую доклиническую оптимизацию и клиническую разработку соединения. Учитывая рост использования фенотипического / визуального скрининга в качестве биологического инструмента клетки, необходимы методы, позволяющие систематически идентифицировать биохимические мишени, если эти молекулы будут широко использоваться. Идентификация цели была определена как этап, ограничивающий скорость в химической генетике / скрининге с высоким содержанием.
Автоматический считыватель конфокальных изображений Технология скрининга с высоким содержанием в основном основана на автоматизированной цифровой микроскопии и проточная цитометрия в сочетании с IT-системами для анализа и хранения данных. Технологии «высококонтентной» или визуальной биологии преследуют две цели: во-первых, получить информацию о событии с пространственным или временным разрешением, а во-вторых, автоматически дать количественную оценку. Приборы с пространственным разрешением - это, как правило, автоматизированные микроскопы, и временное разрешение в большинстве случаев все же требует некоторой формы измерения флуоресценции. Это означает, что многие инструменты HCS представляют собой (флуоресцентные ) микроскопы, которые подключены к той или иной форме пакета анализа изображений. Они позаботятся обо всех этапах получения флуоресцентных изображений клеток и обеспечат быструю, автоматизированную и беспристрастную оценку экспериментов.
Инструменты HCS, представленные сегодня на рынке, можно разделить на основе набора спецификаций, которые существенно влияют на универсальность инструментов и общую стоимость. К ним относятся скорость, камера с живыми клетками, которая включает в себя контроль температуры и CO2 (некоторые также имеют контроль влажности для долгосрочной визуализации живых клеток), встроенный дозатор или инжектор для быстрых кинетических анализов и дополнительные режимы визуализации, такие как конфокальное, яркое поле, фазовый контраст и FRET. Одно из самых существенных различий заключается в том, являются ли инструменты оптическими конфокальными или нет. Конфокальная микроскопия представляет собой визуализацию / разрешение тонкого среза через объект и отклонение не в фокусе света, исходящего извне этого среза. Конфокальная визуализация обеспечивает более высокое соотношение сигнал / шум и более высокое разрешение, чем более широко применяемая эпи- флуоресцентная микроскопия. В зависимости от инструмента конфокальность достигается с помощью лазерного сканирования, одного вращающегося диска с отверстиями или щелями, двойного вращающегося диска или виртуальной щели. Между этими различными конфокальными методами существует компромисс между чувствительностью, разрешением, скоростью, фототоксичностью, фотообесцвечиванием, сложностью инструмента и ценой.
Все инструменты объединяют способность автоматически снимать, хранить и интерпретировать изображения, а также интегрировать их в большие роботизированные платформы для работы с ячейками / средами.
Многие экраны анализируются с помощью программного обеспечения для анализа изображений, которое прилагается к прибору, обеспечивая готовое решение. Альтернативы стороннему программному обеспечению часто используются для особо сложных экранов или в тех случаях, когда лаборатория или учреждение имеет несколько инструментов и желает стандартизировать их до единой аналитической платформы. Некоторое программное обеспечение прибора обеспечивает массовый импорт и экспорт изображений и данных для пользователей, которые хотят выполнить такую стандартизацию на единой платформе анализа без использования стороннего программного обеспечения.
Эта технология позволяет проводить (очень) большое количество экспериментов, позволяя проводить исследовательский скрининг. Клеточные системы в основном используются в химической генетике, где систематически проверяются большие и разнообразные коллекции малых молекул на предмет их влияния на клеточные модельные системы. Новые лекарства можно найти с помощью экранов из десятков тысяч молекул, и это многообещающее будущее для разработки лекарств. Помимо открытия лекарств, химическая генетика направлена на функционализацию генома путем выявления небольших молекул, которые действуют на большую часть из 21 000 генных продуктов в клетке. Частью этих усилий станет технология с высоким содержанием контента, которая может предоставить полезные инструменты для изучения того, где и когда действуют белки, выбивая их химическим путем. Это было бы наиболее полезно для гена, в котором мышей с нокаутом (отсутствием одного или нескольких генов) невозможно получить, потому что белок необходим для развития, роста или иным образом летален, когда его нет. Химический нокаут может решить, как и где работают эти гены. Кроме того, эта технология используется в сочетании с РНКи для идентификации наборов генов, участвующих в определенных механизмах, например делении клеток. Здесь библиотеки РНК, охватывающие весь набор предсказанных генов в геноме целевого организма, могут использоваться для идентификации соответствующих подмножеств, облегчая аннотацию генов, для которых заранее не установлена четкая роль. Большие наборы данных, создаваемые автоматизированной клеточной биологией, содержат количественные данные с пространственным разрешением, которые можно использовать для построения моделей системного уровня и моделирования функционирования клеток и организмов. Модели системной биологии функции клетки позволят предсказать, почему, где и как клетка реагирует на внешние изменения, рост и болезнь.
Технология высокопроизводительного скрининга позволяет оценивать множество биохимических и морфологических параметров в интактных биологических системах.
Для клеточных подходов полезность автоматизированной клеточной биологии требует изучения того, как автоматизация и объективные измерения могут улучшить экспериментирование и понимание болезни. Во-первых, он устраняет влияние исследователя в большинстве, но не во всех аспектах исследования клеточной биологии, а во-вторых, делает возможными совершенно новые подходы.
В обзоре классическая клеточная биология 20-го века использовала клеточные линии, выращенные в культуре, где эксперименты были измерены с использованием методов, очень похожих на описанные здесь, но там исследователь сделал выбор относительно того, что и как измерять. В начале 1990-х разработка камер CCD (устройство с зарядовой связью камеры ) для исследований дала возможность измерять особенности изображений клеток, например, как сколько белка находится в ядре, сколько снаружи. Вскоре последовали сложные измерения с использованием новых флуоресцентных молекул, которые используются для измерения таких свойств клеток, как концентрации вторичных мессенджеров или pH внутренних компартментов клетки. Широкое использование зеленого флуоресцентного белка, естественной флуоресцентной белковой молекулы медуз, затем ускорило тенденцию к созданию изображений клеток как основной технологии в клеточной биологии. Несмотря на эти достижения, исследователь все еще выбирал, какую ячейку отображать, какие данные представлять и как их анализировать.
По аналогии, если кто-то представит футбольное поле и накрытые на него обеденные тарелки, вместо того, чтобы смотреть на них все, следователь выберет горстку возле линии счета и должен будет оставить остальные. В этой аналогии поле - это чашка для культивирования тканей, на пластинах - клетки, растущие на ней. Хотя это был разумный и прагматичный подход, автоматизация всего процесса и анализа делает возможным анализ всей популяции живых клеток, так что все футбольное поле может быть измерено.
