Войти
 Секвенаторы ДНК | |
| Производители | Roche, Illumina, Life Technologies, Beckman Coulter, Pacific Biosciences, MGI / BGI, Oxford Nanopore Technologies |
|---|---|
A секвенатор ДНК - это научный инструмент, используемый для автоматизации процесса секвенирования ДНК. По образцу ДНК секвенатор ДНК используется для определения порядка четырех оснований: G (гуанин ), C (цитозин ), A ( аденин ) и Т (тимин ). Затем об этом сообщается как текст строка, называемая чтением. Некоторые секвенаторы ДНК также могут считаться оптическими приборами, поскольку они анализируют световые сигналы, исходящие от флуорохромов, прикрепленных к нуклеотидам.
Первый автоматический секвенатор ДНК, изобретенный Ллойдом. M. Smith, была представлена Applied Biosystems в 1987 году. В ней использовался метод секвенирования по Сэнгеру, технология, которая легла в основу «первого поколения» секвенаторов ДНК и позволили завершить проект генома человека в 2001 году. Это первое поколение секвенаторов ДНК представляет собой по существу автоматизированные системы электрофореза, которые обнаруживают миграцию меченых фрагментов ДНК. Следовательно, эти секвенаторы также можно использовать в генотипировании генетических маркеров, когда необходимо определять только длину фрагмента (ов) ДНК (например, микросателлиты, AFLP ).
Проект генома человека стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и более точных платформ, известных как секвенаторы следующего поколения (NGS), для секвенирования генома человека.. К ним относятся платформы секвенирования ДНК 454, SOLiD и Illumina. Машины секвенирования нового поколения существенно увеличили скорость секвенирования ДНК по сравнению с предыдущими методами Сэнгера. Образцы ДНК можно приготовить автоматически всего за 90 минут, в то время как геном человека можно секвенировать с 15-кратным охватом за считанные дни.
Более современные секвенаторы ДНК третьего поколения, такие как SMRT и Oxford Nanopore измеряют добавление нуклеотидов к отдельной молекуле ДНК в реальном времени.
Из-за ограничений технологии секвенатора ДНК эти чтения короткие по сравнению с длиной генома, поэтому чтения должны быть собраны в более длинные контиги. Данные также могут содержать ошибки, вызванные ограничениями в методике секвенирования ДНК или ошибками во время ПЦР-амплификации. Производители секвенаторов ДНК используют ряд различных методов для определения присутствующих оснований ДНК. Конкретные протоколы, применяемые на разных платформах секвенирования, влияют на генерируемые окончательные данные. Поэтому сравнение качества и стоимости данных по разным технологиям может оказаться сложной задачей. Каждый производитель предоставляет свои собственные способы информирования об ошибках секвенирования и баллах. Однако ошибки и оценки между разными платформами не всегда можно напрямую сравнивать. Поскольку в этих системах используются различные подходы к секвенированию ДНК, выбор лучшего секвенатора ДНК и метода обычно будет зависеть от целей эксперимента и доступного бюджета.
Первые методы секвенирования ДНК были разработаны Гилбертом (1973) и Сангером (1975). Гилберт представил метод секвенирования, основанный на химической модификации ДНК с последующим расщеплением по конкретным основаниям, тогда как метод Сэнгера основан на терминации цепи дидезоксинуклеотида . Метод Сенгера стал популярным благодаря своей повышенной эффективности и низкой радиоактивности. Первым автоматическим секвенатором ДНК был AB370A, представленный в 1986 г. компанией Applied Biosystems. AB370A был способен секвенировать 96 образцов одновременно, 500 тысяч оснований в день и достигать длины считывания до 600 оснований. Это было началом «первого поколения» секвенаторов ДНК, в которых реализовано секвенирование по Сэнгеру, флуоресцентные дидезоксинуклеотиды и полиакриламидный гель, помещенный между стеклянными пластинами - пластинчатыми гелями. Следующим крупным достижением стал выпуск в 1995 году AB310, в котором для разделения цепей ДНК с помощью электрофореза использовался линейный полимер в капилляре вместо пластинчатого геля. Эти методы легли в основу завершения проекта генома человека в 2001 году. Проект генома человека стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и точных платформ, известных как секвенсоры нового поколения (NGS). В 2005 году 454 Life Sciences выпустила секвенатор 454, за которым последовали Solexa Genome Analyzer и SOLiD (поддерживаемое обнаружение лигирования олигонуклеотидов) от Agencourt в 2006 году. Applied Biosystems приобрела Agencourt в 2006 году, а в 2007 году Roche купил 454 Life Sciences, а Illumina купила Solexa. Ion Torrent вышел на рынок в 2010 году и был приобретен компанией Life Technologies (ныне Thermo Fisher Scientific). И BGI начала производство секвенсоров в Китае после приобретения Complete Genomics под своим MGI подразделением. Это по-прежнему самые распространенные системы NGS из-за их конкурентоспособной стоимости, точности и производительности.
Совсем недавно было представлено третье поколение секвенаторов ДНК. Методы секвенирования, применяемые этими секвенаторами, не требуют амплификации ДНК (полимеразная цепная реакция - ПЦР), что ускоряет подготовку образца перед секвенированием и снижает количество ошибок. Кроме того, данные секвенирования собираются из реакций, вызванных добавлением нуклеотидов в комплементарной цепи в режиме реального времени. Две компании представили разные подходы в своих секвенаторах третьего поколения. Секвенсоры Pacific Biosciences используют метод, называемый одномолекулярным в реальном времени (SMRT), где данные секвенирования производятся с помощью света (захваченного камерой), излучаемого, когда нуклеотид добавляется к комплементарной цепи ферментами, содержащими флуоресцентные красители. Oxford Nanopore Technologies - еще одна компания, разрабатывающая секвенаторы третьего поколения с использованием электронных систем, основанных на технологиях обнаружения нанопор.
Секвенаторы ДНК были разработаны, изготовлены и проданы, среди прочего, следующими компаниями.
Секвенатор ДНК 454 стал первым секвенатором нового поколения, который стал коммерчески успешным. Он был разработан 454 Life Sciences и приобретен Roche в 2007 году. 454 использует обнаружение пирофосфата, высвобождаемого в результате реакции ДНК-полимеразы, при добавлении нуклеотида к матричному штамму.
Рош в настоящее время производит две системы, основанные на своей технологии пиросеквенирования: GS FLX + и GS Junior System. Система GS FLX + обещает длину считывания примерно 1000 пар оснований, в то время как система GS Junior обещает считывать 400 пар оснований. Предшественник GS FLX +, система 454 GS FLX Titanium была выпущена в 2008 году, обеспечивая выход 0,7 ГБ данных за цикл, с точностью 99,9% после качественного фильтра и длиной считывания до 700 бит / с. В 2009 году Roche выпустила GS Junior, настольную версию секвенсора 454 с длиной считывания до 400 пар оснований и упрощенной подготовкой библиотеки и обработкой данных.
Одним из преимуществ систем 454 является их скорость работы. Человеческие ресурсы могут быть сокращены за счет автоматизации подготовки библиотеки и полуавтоматизации эмульсионной ПЦР. Недостатком системы 454 является то, что она склонна к ошибкам при оценке числа оснований в длинной цепочке идентичных нуклеотидов. Это называется ошибкой гомополимера и возникает, когда в ряду 6 или более одинаковых оснований. Еще один недостаток заключается в том, что реагенты стоят относительно дороже по сравнению с другими секвенаторами следующего поколения.
В 2013 году компания Roche объявила, что прекратит разработку 454 технологий и полностью выведет из эксплуатации 454 машины в 2016 году.
Roche производит ряд программных инструментов, оптимизированных для анализа 454 машин. данные секвенирования. GS Run Processor преобразует необработанные изображения, созданные в процессе секвенирования, в значения интенсивности. Процесс состоит из двух основных этапов: обработки изображения и обработки сигнала. Программное обеспечение также применяет нормализацию, коррекцию сигнала, базовый вызов и оценки качества для отдельных считываний. Программное обеспечение выводит данные в файлах стандартного формата блок-схемы (или SFF) для использования в приложениях анализа данных (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper или GS Amplicon Variant Analyzer). GS De Novo Assembler - это инструмент для сборки de novo полных геномов размером до 3 ГБ из одних только считываний или в сочетании с парными конечными данными, созданными 454 секвенсорами. Он также поддерживает сборку транскриптов de novo (включая анализ), а также обнаружение вариантов изоформы. GS Reference Mapper сопоставляет короткие чтения с эталонным геномом, генерируя согласованную последовательность. Программное обеспечение может генерировать выходные файлы для оценки с указанием вставок, удалений и SNP. Может обрабатывать большие и сложные геномы любого размера. Наконец, анализатор вариантов GS Amplicon сопоставляет показания образцов ампликона с эталоном, идентифицируя варианты (связанные или нет) и их частоту. Его также можно использовать для обнаружения неизвестных и низкочастотных вариантов. Он включает графические инструменты для анализа сопоставлений.
Секвенатор Illumina Genome Analyzer II Illumina производит ряд секвенирующих машин нового поколения с использованием технологий, приобретенных у Manteia Predictive Медицина и разработана Solexa. Illumina производит ряд секвенаторов следующего поколения, использующих эту технологию, включая HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq и HiScanSQ, которые также могут обрабатывать микроматрицы.
. Технология, ведущая к этим секвенаторам ДНК, была впервые выпущена Solexa в 2006 году. как анализатор генома. Illumina приобрела Solexa в 2007 году. Анализатор генома использует метод секвенирования путем синтеза. Первая модель производила 1 Гб за пробег. В течение 2009 года объем производства был увеличен с 20 Гбит / с в августе до 50 Гб в декабре. В 2010 году Illumina выпустила HiSeq 2000 с выходной мощностью 200, а затем 600 Гбайт на цикл, что заняло бы 8 дней. На момент выпуска HiSeq 2000 предоставлял одну из самых дешевых платформ для секвенирования по цене 0,02 доллара за миллион оснований по оценке Пекинского института геномики.
. В 2011 году Illumina выпустила настольный секвенсор под названием MiSeq. На момент выпуска MiSeq мог генерировать 1,5 Гб за прогон с парными чтениями в конце 150 бит / с. Цикл секвенирования может быть выполнен за 10 часов при использовании автоматической подготовки образцов ДНК.
Illumina HiSeq использует два программных инструмента для расчета количества и положения кластеров ДНК для оценки качества секвенирования: система управления HiSeq и анализатор в реальном времени. Эти методы помогают оценить, мешают ли соседние кластеры друг другу.
Life Technologies (теперь Thermo Fisher Scientific) производит секвенаторы ДНК в рамках Applied Biosystems и Ion Torrent бренды. Applied Biosystems создает платформу для секвенирования нового поколения SOLiD и секвенаторы ДНК на основе Сэнгера, такие как 3500 Genetic Analyzer. Под брендом Ion Torrent компания Applied Biosystems производит четыре секвенсора следующего поколения: систему Ion PGM, систему Ion Proton, систему Ion S5 и Ion S5xl. Предполагается также, что компания разрабатывает свой новый секвенатор капиллярной ДНК под названием SeqStudio, который будет выпущен в начале 2018 года.
Системы SOLiD были приобретены Applied Biosystems в 2006 году. SOLiD применяет секвенирование путем лигирования и двухосновное кодирование. Первая система SOLiD была запущена в 2007 году и генерировала данные с длиной считывания 35 бит / с за один прогон. После пяти обновлений в 2010 году была выпущена система секвенирования 5500xl, значительно увеличившая длину чтения до 85 бит / с, повышая точность до 99,99% и производя 30 ГБ за 7-дневный прогон.
Ограниченная длина чтения SOLiD осталась значительный недостаток и до некоторой степени ограничивает его использование экспериментами, где длина считывания менее важна, такими как повторное секвенирование и анализ транскриптома, а также недавние эксперименты с ChIP-Seq и метилированием. Время подготовки образцов ДНК для систем SOLiD стало намного быстрее благодаря автоматизации подготовки библиотек секвенирования, таких как система Tecan.
Данные цветового пространства, полученные с помощью платформы SOLiD, могут быть декодированы в базы ДНК для дальнейшего анализа, однако программное обеспечение, которое учитывает исходную информацию о цветовом пространстве, может дать более точные результаты. Life Technologies выпустила BioScope, пакет анализа данных для повторного секвенирования, ChiP-Seq и анализа транскриптома. Он использует алгоритм MaxMapper для сопоставления чтения цветового пространства.
Beckman Coulter (сейчас Danaher ) ранее производила секвенаторы ДНК на основе терминации цепи и капиллярного электрофореза под названием CEQ, включая CEQ 8000. теперь компания производит систему генетического анализа GeXP, в которой используется секвенирование терминатора красителя. В этом методе используется термоциклер почти так же, как и ПЦР для денатурирования, отжига и удлинения фрагментов ДНК, амплификации секвенированных фрагментов.
Pacific Biosciences производит системы секвенирования PacBio RS и Sequel, используя метод секвенирования одиночных молекул в реальном времени, или SMRT, метод. Эта система может производить считанные длины в несколько тысяч пар оснований. Более высокие необработанные ошибки чтения исправляются либо с помощью кругового консенсуса, когда одна и та же цепочка читается снова и снова, либо с использованием оптимизированных стратегий сборки. Ученые сообщили о точности 99,9999% этих стратегий. Система Sequel была запущена в 2015 году с увеличенной емкостью и более низкой ценой.
Секвенатор Oxford Nanopore MinION (внизу справа) использовался в первом в истории секвенировании ДНК в космосе в августе 2016 года астронавтом Кэтлин Рубинс.Oxford Nanopore Technologies начала поставки ранних версий своего секвенатора нанопор MinION для избранных лабораторий. Устройство имеет длину четыре дюйма и питается от порта USB . MinION декодирует ДНК напрямую, когда молекула протягивается со скоростью 450 оснований в секунду через нанопору, подвешенную в мембране. Изменения электрического тока показывают, какая база присутствует. Его точность составляет от 60 до 85 процентов по сравнению с 99,9 процентами в обычных машинах. Даже неточные результаты могут оказаться полезными, потому что это приводит к большой длине чтения. GridION - это немного больший секвенсор, который обрабатывает до пяти проточных ячеек MinION одновременно. PromethION - еще один (неизданный) продукт, который будет использовать до 100 000 пор параллельно, более подходящий для секвенирования большого объема.
Текущие предложения в области технологии секвенирования ДНК показывают доминирующего игрока: Illumina (декабрь 2019 г.), за которым следуют PacBio, MGI / BGI и Oxford Nanopore.
| Sequencer | Ion Torrent PGM | 454 GS FLX | HiSeq 2000 | SOLiDv4 | PacBio | Sanger 3730xl |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Производитель | Ion Torrent (Life Technologies) | 454 Life Sciences (Roche) | Illumina | Applied Biosystems (Life Technologies) | Pacific Biosciences | Applied Biosystems (Life Technologies).) |
| Химия секвенирования | Ионно-полупроводниковое секвенирование | Пиросеквенирование | Последовательность на основе полимеразы путем синтеза | Секвенирование на основе лигирования | Флуоресцентные нуклеотиды с фосфорированными связями | Дидезокси обрыв цепи |
| Приложение амплификации Roach | ПЦР в эмульсии | ПЦР в эмульсии | Мостиковая амплификация | ПЦР в эмульсии | Одномолекулярная; без амплификации | ПЦР |
| Вывод данных за цикл | 100-200 Мб | 0,7 Гб | 600 Гб | 120 Гб | 0,5 - 1,0 Гб | 1,9∼84 КБ |
| Точность | 99% | 99,9% | 99,9% | 99,94% | 88,0% (>99,9999% CCS или HGAP) | 99,999% |
| Время выполнения | 2 часа | 24 часа | 3–10 дней | 7–14 дней | 2–4 часа | 20 минут - 3 часа |
| Длина считывания | 200-400 б.п. | 700 б.п. | 100x100 б.п. парный конец | парный конец 50x50 б.п. | 14000 б.п. (N50 ) | 400-900 п.н. |
| Стоимость за запуск | 350 долларов США | 7000 долларов США | 6000 долларов США (30x геном человека) | 4000 долларов США | 125–300 долларов США | 4 доллара США (одно чтение / реакция) |
| Стоимость за Мб | 1 доллар США | 10 долларов США | 0,07 доллара США | 0,13 доллара США | 0,13 доллара США - 0,60 доллара США | 2400 долларов США |
| Стоимость одного инструмента | 80 000 долларов США | 500 000 долларов США | 690 000 долларов США | 495 000 долларов США | 695 000 долларов США | 95 000 долларов США |
