Войти
| Промышленность | Биотехнологии |
|---|---|
| Судьба | Приобретено Roche в 2007 г. и закрыта компанией Roche в 2013 г. (производство прекращено в середине 2016 г.) |
| Основание | 2000 |
| Головной офис | Бранфорд, Коннектикут, США |
| Продукция | Секвенаторы генома, реагенты |
| Услуги | Секвенирование генетических образцов |
454 Life Sciences была биотехнологической компанией, базирующейся в Бранфорде, Коннектикут которая специализируется на высокопроизводительном секвенировании ДНК. Он был приобретен Roche в 2007 году и закрыт в 2013 году, когда его технология стала неконкурентоспособной, хотя производство продолжалось до середины 2016 года.
454 Life Sciences была основана Джонатаном Ротбергом и первоначально известная как 454 Corporation, дочерняя компания CuraGen. За свой метод недорогого секвенирования генов компания 454 Life Sciences была награждена золотой медалью Wall Street Journal за инновации в категории биотехнологий и медицины в 2005 году. Название 454 было кодовым названием, под которым проект упоминался в CuraGen, и числа не имеют известного особого значения.
В ноябре 2006 года Ротберг, Майкл Эгхолм и коллеги из 454 опубликовали статью с Сванте Пяабо в Nature, описывающую первый миллион пар оснований генома неандертальца и инициировал проект генома неандертальца для завершения последовательности генома неандертальца к 2009 году.
В конце марта 2007 года «Рош Диагностика» приобрела 454 Life Sciences за 154,9 млн долларов США. Это оставалось отдельным бизнес-подразделением. В октябре 2013 года компания «Рош» объявила о закрытии 454 и прекращении поддержки платформы к середине 2016 года.
В мае 2007 года компания 454 опубликовала результаты проекта «Джим»: секвенирование генома Джеймс Уотсон, соавтор открытия структуры ДНК.
454 При секвенировании использовалась крупномасштабная параллельная система пиросеквенирования, способная примерно 400-600 мегабаз ДНК за 10 часов прогона на секвенсоре генома FLX с реагентами серии GS FLX Titanium.
Система полагалась на фиксацию распыленных и фрагментов на небольших шариках для захвата ДНК в эмульсия типа вода в масле . ДНК, закрепленную на этих шариках, затем амплифицировали с помощью ПЦР. Каждую связанную с ДНК гранулу помещали в лунку размером ~ 29 мкм на PicoTiterPlate, волоконно-оптическом чипе. Смесь ферментов, таких как ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза и люцифераза, также была упакована в лунку. Затем PicoTiterPlate помещали в систему GS FLX для секвенирования.
454 выпустила секвенатор GS20 в 2005 году, первый секвенатор ДНК следующего поколения на рынке. В 2008 году компания 454 Sequencing выпустила реагенты серии GS FLX Titanium для использования в приборе Genome Sequencer FLX, с возможностью секвенирования 400-600 миллионов пар оснований за цикл с длиной считывания 400-500 пар оснований. В конце 2009 года компания 454 Life Sciences представила GS Junior System, настольную версию системы Genome Sequencer FLX.
Геномная ДНК была фракционирована на более мелкие фрагменты (300 -800 пар оснований) и отполированы (сделаны тупыми с каждого конца). Затем к концам фрагментов лигировали короткие адаптеры. Эти адаптеры обеспечивали прайминговые последовательности как для амплификации, так и для секвенирования фрагментов библиотеки образцов. Один адаптер (адаптер B) содержал метку 5'- биотин для иммобилизации библиотеки ДНК на шариках, покрытых стрептавидином. После репарации разрывов небиотинилированная цепь высвобождалась и использовалась в качестве библиотеки одноцепочечной матричной ДНК (sstDNA). Библиотеку sstDNA оценивали на предмет ее качества, и оптимальное количество (копий ДНК на шарик), необходимое для emPCR, определяли титрованием.
Библиотеку sstDNA иммобилизовали на шариках. Гранулы, содержащие фрагмент библиотеки, несли одну молекулу sstDNA. Связанную с гранулами библиотеку эмульгировали с реагентами для амплификации в смеси вода-в-масле. Каждая гранула была захвачена в своем собственном микрореакторе, где происходит ПЦР-амплификация. Это привело к получению клонально амплифицированных фрагментов ДНК, иммобилизованных на гранулах.
Гранулы библиотеки одноцепочечной матричной ДНК добавляли в смесь для инкубации гранул ДНК (содержащую ДНК-полимеразу) и наслаивали ферментные гранулы (содержащие сульфурилазу и люциферазу) на устройство PicoTiterPlate. Устройство центрифугировали для внесения шариков в лунки. Слой ферментных шариков гарантировал, что шарики ДНК оставались в лунках во время реакции секвенирования. Процесс осаждения гранул был разработан для максимального увеличения количества лунок, содержащих одну гранулу амплифицированной библиотеки.
Загруженное устройство PicoTiterPlate помещали в прибор Genome Sequencer FLX. Подсистема флюидики доставляла реагенты для секвенирования (содержащие буферы и нуклеотиды) через лунки планшета. Четыре нуклеотида ДНК добавляли последовательно в фиксированном порядке через устройство PicoTiterPlate во время цикла секвенирования. Во время потока нуклеотидов параллельно секвенировали миллионы копий ДНК, связанных с каждой из гранул. Когда в лунку добавляли нуклеотид , комплементарный цепи матрицы, полимераза удлиняла существующую цепь ДНК, добавляя нуклеотид (ы). Добавление одного (или нескольких) нуклеотидов генерировало световой сигнал, который регистрировался камерой CCD в приборе. Этот метод был основан на секвенировании путем синтеза и получил название пиросеквенирование. Сила сигнала была пропорциональна количеству нуклеотидов; например, отрезки гомополимера, включенные в единичный нуклеотидный поток, генерируют больший сигнал, чем одиночные нуклеотиды. Однако сила сигнала для гомополимерных участков была линейной только до восьми последовательных нуклеотидов, после чего сигнал быстро падал. Данные сохраняли в файлах стандартного формата блокограммы (SFF) для последующего анализа.
