Войти
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК основан на избирательном включении обрывающих цепь дидезоксинуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы во время репликации ДНК in vitro . После того, как он был впервые разработан Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году, он стал наиболее широко используемым методом секвенирования примерно на 40 лет. Впервые он был коммерциализирован компанией Applied Biosystems в 1986 году. В последнее время более объемное секвенирование по Сэнгеру было заменено методами секвенирования «Next-Gen», особенно для крупномасштабных автоматизированных анализ генома. Однако метод Сэнгера по-прежнему широко используется для небольших проектов и для проверки результатов Next-Gen. Он по-прежнему имеет преимущество перед технологиями секвенирования с коротким считыванием (такими как Illumina) в том, что он может производить считывания последовательности ДНК>500 нуклеотидов.
Метод Сэнгера (обрыва цепи) для секвенирования ДНК. 
Флуоресцентные молекулы ddNTP Классическая цепочка Для метода -терминации требуется матрица одноцепочечной ДНК, ДНК праймер, ДНК-полимераза, нормальные дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP) и модифицированные ди-дезоксинуклеотидтрифосфаты (ddNTP), последние из которых прекращают удлинение цепи ДНК. В этих обрывающих цепь нуклеотидах отсутствует группа 3'- OH, необходимая для образования фосфодиэфирной связи между двумя нуклеотидами, в результате чего ДНК-полимераза прекращает удлинение ДНК при включении модифицированного ddNTP.. DdNTP могут быть помечены радиоактивно или флуоресцентно для обнаружения в автоматических машинах для секвенирования.
Образец ДНК разделяется на четыре отдельные реакции секвенирования, содержащие все четыре стандартных дезоксинуклеотида (dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и ДНК-полимеразу. К каждой реакции добавляется только один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP), тогда как другие добавленные нуклеотиды являются обычными. Концентрация дезоксинуклеотида должна быть примерно в 100 раз выше, чем концентрация соответствующего дидезоксинуклеотида (например, 0,5 мМ dTTP: 0,005 мМ ddTTP), чтобы обеспечить образование достаточного количества фрагментов при сохранении транскрипции полной последовательности (но концентрация ddNTP также зависит от желаемого длина последовательности). Выражаясь в более разумном порядке, в этом процессе необходимы четыре отдельных реакции для тестирования всех четырех ddNTP. После раундов удлинения матричной ДНК из связанного праймера полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза. В оригинальной публикации 1977 года образование спаренных по основанию петель оцДНК было причиной серьезных трудностей в разрешении полос в некоторых местах. Это часто выполняется с использованием денатурирующего геля полиакриламид -мочевины, при этом каждая из четырех реакций проходит на одной из четырех отдельных дорожек (дорожки A, T, G, C). Полосы ДНК затем могут быть визуализированы с помощью авторадиографии или УФ-света, а последовательность ДНК может быть непосредственно считана с рентгеновской пленки или изображения геля.
Часть геля для секвенирования с радиоактивной меткой На изображении справа рентгеновская пленка подвергалась воздействию геля, а темные полосы соответствуют фрагментам ДНК разной длины. Темная полоса на дорожке указывает на фрагмент ДНК, который является результатом обрыва цепи после включения дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP). Затем относительные положения различных полос на четырех полосах снизу вверх используются для считывания последовательности ДНК.
Фрагменты ДНК помечены радиоактивной или флуоресцентной меткой на праймере (1), в новой цепи ДНК - меченым dNTP или меченным ddNTP. Технические варианты секвенирования с окончанием цепи включают мечение нуклеотидами содержащие радиоактивный фосфор для радиоактивной метки или с использованием праймера, помеченного на 5'-конце флуоресцентным красителем . Секвенирование красителей и праймеров облегчает считывание в оптической системе для более быстрого и экономичного анализа и автоматизации. Более поздняя разработка Leroy Hood и соавторами флуоресцентно меченных ddNTP и праймеров заложила основу для автоматизированного высокопроизводительного секвенирования ДНК.
Последовательная лестница путем радиоактивного секвенирования по сравнению с флуоресцентными пиками Обрыв цепи методы значительно упростили секвенирование ДНК. Например, коммерчески доступны наборы на основе обрыва цепи, которые содержат реагенты, необходимые для секвенирования, предварительно аликвотированные и готовые к использованию. Ограничения включают неспецифическое связывание праймера с ДНК, влияющее на точное считывание последовательности ДНК, и вторичные структуры ДНК, влияющие на точность последовательности.
Капиллярный электрофорез При секвенировании с терминатором с красителем используется мечение ддНТФ с терминатором обрыва цепи, что позволяет проводить секвенирование в одной реакции, а не в четырех реакциях, как в методе меченых праймеров. При секвенировании терминатора с красителем каждый из четырех терминаторов дидезоксинуклеотидной цепи метят флуоресцентными красителями, каждый из которых излучает свет с разными длинами волн.
. Благодаря большей целесообразности и скорости секвенирование терминатора с использованием красителя в настоящее время является основой в автоматическое секвенирование. Его ограничения включают эффекты красителя из-за различий во включении меченных красителем терминаторов цепи во фрагмент ДНК, что приводит к неодинаковым высотам и формам пиков на электронной кривой последовательности ДНК хроматограмма после капиллярного электрофореза (см. Рисунок слева).
Эта проблема была решена с использованием модифицированных ферментных систем ДНК-полимеразы и красителей, которые минимизируют вариабельность включения, а также способов устранения «пятен красителя». Метод секвенирования с использованием красителя-терминатора, наряду с автоматизированными высокопроизводительными анализаторами последовательности ДНК, использовался в подавляющем большинстве проектов секвенирования до появления технологии секвенирования нового поколения.
Вид начала примера считывания терминатора красителя Инструменты для автоматического секвенирования ДНК (секвенаторы ДНК ) могут секвенировать до 384 образцов ДНК в единичная партия. Пакетные прогоны могут выполняться до 24 раз в день. Секвенсоры ДНК разделяют нити по размеру (или длине) с помощью капиллярного электрофореза, они обнаруживают и регистрируют флуоресценцию красителя и выводят данные в виде хроматограмм флуоресцентных пиков . Реакции секвенирования (термоциклирование и маркировка), очистка и ресуспендирование образцов в буферном растворе выполняются отдельно перед загрузкой образцов в секвенатор. Ряд коммерческих и некоммерческих программных пакетов могут автоматически обрезать некачественные следы ДНК. Эти программы оценивают качество каждого пика и удаляют базовые пики низкого качества (которые обычно расположены на концах последовательности). По точности такие алгоритмы уступают визуальному осмотру человеком-оператором, но подходят для автоматизированной обработки больших наборов данных последовательности.
Общие проблемы секвенирования ДНК с помощью метода Сэнгера включают низкое качество первых 15-40 оснований последовательности из-за связывания праймера и ухудшение качества следов секвенирования после 700-900 оснований. Программное обеспечение для вызова базы, такое как Phred, обычно обеспечивает оценку качества, чтобы помочь в обрезке низкокачественных участков последовательностей.
В случаях, когда фрагменты ДНК клонируются раньше После секвенирования полученная последовательность может содержать части вектора клонирования . Напротив, в технологиях клонирования на основе ПЦР и секвенирования следующего поколения, основанных на пиросеквенировании, часто не используются векторы для клонирования. Недавно были разработаны методы одноэтапного секвенирования по Сэнгеру (комбинированная амплификация и секвенирование), такие как Ampliseq и SeqSharp, которые позволяют быстро секвенировать целевые гены без клонирования или предварительной амплификации.
Современные методы могут напрямую секвенировать только относительно короткие ( 300-1000 нуклеотидов длиной) фрагментов ДНК в одной реакции. Основным препятствием для секвенирования фрагментов ДНК, превышающих этот предел размера, является недостаточная способность разделения для разделения больших фрагментов ДНК, которые отличаются по длине только на один нуклеотид.
Микрожидкостное секвенирование по Сэнгеру - это лаборатория-на-чипе приложение для секвенирования ДНК, в котором этапы секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование, очистка образцов, и капиллярный электрофорез) интегрированы в чип в масштабе пластины с использованием объемов образца в нанолитровом масштабе. Эта технология генерирует длинные и точные считывания последовательностей, устраняя при этом многие существенные недостатки традиционного метода Сэнгера (например, высокий расход дорогостоящих реагентов, использование дорогостоящего оборудования, трудоемкие операции и т. Д.) За счет интеграции и автоматизации этапов секвенирования по Сэнгеру..
В настоящее время высокопроизводительное секвенирование генома включает фрагментирование генома на небольшие одноцепочечные части с последующей амплификацией фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применяя метод Сэнгера, каждый фрагмент ДНК необратимо обрывается с включением флуоресцентно меченного дидезокси-цепи нуклеотида, обрывающего цепь, тем самым образуя «лестницу» ДНК из фрагментов, каждый из которых отличается по длине на одно основание и несет специфичную для основания флуоресцентную метку на терминальная база. Затем амплифицированные лестницы оснований разделяют с помощью электрофореза на капиллярной матрице (CAE) с автоматическим обнаружением in situ «финишной черты» флуоресцентно меченных фрагментов оцДНК, что обеспечивает упорядоченную последовательность фрагментов. Эти считывания последовательностей затем собираются компьютером в перекрывающиеся или смежные последовательности (называемые «контиги»), которые напоминают полную геномную последовательность после полной сборки.
Методы Сэнгера обеспечивают длину считывания приблизительно 800 п.н. (обычно 500-600 п.н. с не- обогащенная ДНК). Большая длина чтения в методах Сэнгера демонстрирует значительные преимущества перед другими методами секвенирования, особенно с точки зрения секвенирования повторяющихся областей генома. Проблема с данными коротко-считываемых последовательностей особенно актуальна при секвенировании новых геномов (de novo) и при секвенировании сильно перестроенных сегментов генома, обычно тех, которые наблюдаются в геномах рака или в областях хромосом, которые демонстрируют структурные вариации.
Другие полезные применения секвенирования ДНК включают обнаружение однонуклеотидного полиморфизма (SNP), однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) гетеродуплекс анализ и анализ с коротким тандемным повторением (STR). Разрешение фрагментов ДНК в соответствии с различиями в размере и / или конформации является наиболее важным этапом в изучении этих особенностей генома.
Чип секвенирования имеет четырехслойную конструкцию, состоящую из из трех стеклянных пластин диаметром 100 мм (на которых микропроизводятся элементы устройства) и полидиметилсилоксановой (ПДМС) мембраны. Реакционные камеры и каналы капиллярного электрофореза протравлены между двумя верхними стеклянными пластинами, которые термически соединены. Трехмерные межсоединения каналов и микроклапаны образованы ПДМС и стеклянной пластиной нижнего коллектора.
Устройство состоит из трех функциональных блоков, каждый из которых соответствует этапам секвенирования по Сэнгеру. Блок термоциклирования (TC) представляет собой реакционную камеру объемом 250 нанолитров со встроенным резистивным датчиком температуры, микроклапанами и поверхностным нагревателем. Перемещение реагента между верхним цельностеклянным слоем и нижним слоем стекло-PDMS происходит через сквозные отверстия диаметром 500 мкм. После термоциклирования реакционная смесь проходит очистку в камере улавливания / очистки, а затем вводится в камеру капиллярного электрофореза (CE). Блок CE состоит из 30-сантиметрового капилляра, который свернут в компактную структуру с помощью витков шириной 65 мкм.
Платформа Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Дублин, Калифорния) объединяет первые два этапа секвенирования по Сэнгеру (термоциклирование и очистка) в полностью автоматизированной системе. Производитель заявляет, что образцы готовы к капиллярному электрофорезу в течение трех часов после загрузки образца и реагентов в систему. Платформа Apollo 100 требует субмикролитровых объемов реагентов.
| Технология | Количество дорожек | Объем инъекции ( nL) | Время анализа | Средняя длина считывания | Пропускная способность (включая анализ; Мб / h ) | заливка геля | Отслеживание дорожек |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Slab gel | 96 | 500–1000 | 6–8 часов | 700 бит / с | 0,0672 | Да | Да |
| Капиллярный массив электрофорез | 96 | 1–5 | 1–3 часа | 700 п.н. | 0,166 | No | Нет |
| Microchip | 96 | 0,1–0,5 | 6–30 минут | 430 п.н. | 0,660 | No | № |
| 454 / Roche FLX (2008) | < 0.001 | 4 часа | 200-300 п.н. | 20–30 | |||
| Illumina / Solexa (2008) | 2–3 дня | 30–100 п.н. | 20 | ||||
| ABI / SOLiD (2008) | 8 дней | 35 п.н. | 5–15 | ||||
| Illumina MiSeq (2019) | 1–3 дня | 2x75–2x300 п.н. | 170–250 | ||||
| Illumina NovaSeq (2019) | 1–2 дня | 2x50–2x150 п.н. | 22 000–67 000 | ||||
| Ion Torrent Ion 530 (2019) | 2,5–4 часа | 200–600 п.н. | 110–920 | ||||
| BGI MGISEQ-T7 (2019) | 1 день | 2x150 bp | 250,000 | ||||
| Pacific Biosciences SMRT (2019) | 10–20 часов | 10–30 kb | 1,300 | ||||
| Oxford Nanopore MinIon (2019) | 3 дня | 13–20 kb | 700 |
Конечной целью высокопроизводительного секвенирования является разработка недорогих систем, и чрезвычайно эффективен при увеличении (большей) длины чтения. Увеличение длины чтения каждого отдельного электрофоретического разделения существенно снижает стоимость, связанную с секвенированием ДНК de novo, и количество матриц, необходимых для секвенирования контигов ДНК с заданной избыточностью. Microfluidics может обеспечить более быструю, дешевую и легкую сборку последовательностей.
