Транспозоны как генетический инструмент

Транспозоны - это полу- паразитические последовательности ДНК, которые могут реплицируются и распространяются через геном хозяина. Их можно использовать в качестве генетического инструмента для анализа функции гена и белка. Использование транспозонов хорошо развито у Drosophila (в котором наиболее часто используются P-элементы ) и в кресс-салате Thale (Arabidopsis thaliana ) и таких бактериях, как Escherichia coli (E. coli).

В настоящее время транспозоны могут использоваться в генетических исследованиях и рекомбинантной генной инженерии для инсерционного мутагенеза. Инсерционный мутагенез - это когда транспозоны функционируют как векторы, помогая удалять и интегрировать генетические последовательности. Учитывая их относительно простую конструкцию и присущую им способность перемещать последовательности ДНК, транспозоны очень совместимы при трансдукции генетического материала, что делает их идеальными генетическими инструментами.

• 1 Мутагенез с пометкой сигнатур
• 2 Инсерционная инактивация
  • 2.1 Спящая красавица
• 3 P Элементы как инструмент (дрозофила)
  • 3.1 Способы использования (дрозофила)
    • 3.1.1 Трансформация мухи
    • 3.1.2 Вставной мутагенез
      • 3.1.2.1 † Захват энхансера
  • 3.2 Другое использование P-элементов (дрозофила)
    • 3.2.1 Вторичная мобилизация
  • 3.3 Анализ продуктов мутагенеза ( Drosophila)
    • 3.3.1 Обратная ПЦР
    • 3.3.2 Спасение плазмид (трансформация E. coli)
• 4 Применение переносимых элементов Другие организмы
• 5 Ссылки
• 6 Дополнительная литература

Мутагенез с пометкой сигнатур (также известный как STM) - это метод, направленный на использование вставки мобильного элемента для определения фенотипа локуса в геноме организма. Хотя методы генетического секвенирования могут определять генотип генома, они не могут определять функцию или фенотипическую экспрессию последовательностей генов. STM может обойти эту проблему, мутируя локус, заставляя его формировать новый фенотип; сравнивая наблюдаемые фенотипические выражения мутированного и неизмененного локуса, можно вывести фенотипическое выражение локуса.

В STM специально помеченные транспозоны вставляются в организм, такой как бактерия, и случайным образом интегрируются в геном хозяина. Теоретически модифицированный мутантный организм должен экспрессировать измененный ген, изменяя таким образом фенотип. Если наблюдается новый фенотип, геном секвенируется и ищется помеченные транспозоны. Если сайт интеграции транспозона обнаружен, то локус может быть ответственным за экспрессию фенотипов.

Было проведено множество исследований STM на основе транспозонов, в первую очередь с P-элементами у Drosophila. Р-элементы представляют собой транспозоны, первоначально описанные в геноме Drosophila melanogaster, которые могут быть искусственно синтезированы или распространены на другие виды Drosophila посредством горизонтального переноса. В ходе экспериментальных испытаний искусственно созданные элементы P и гены транспозаз вставляются в геномы эмбрионов дрозофилы. Впоследствии геномы эмбрионов с мутациями секвенируются и сравниваются, что позволяет выявить локусы, на которые повлияла инсерция, и роли локусов.,

инактивация инсерции фокусируется на подавлении экспрессия гена путем нарушения его последовательности вставкой. Когда дополнительные нуклеотиды вставляются рядом с локусом или в него, этот локус может страдать от мутации сдвига рамки считывания, которая может препятствовать его правильной экспрессии в полипептидной цепи. Инсерционная инактивация на основе транспозонов рассматривается в медицинских исследованиях от подавления устойчивости к антибиотикам у бактерий до лечения генетических заболеваний. При лечении генетических заболеваний вставка транспозона в локус вредного гена генома организма приведет к смещению последовательности локуса, усекая любые образованные вредные белки и делая их нефункциональными. В качестве альтернативы инсерционная инактивация может использоваться для подавления генов, которые выражают устойчивость к антибиотикам у бактерий.

Sleeping Beauty

Хотя транспозоны успешно применялись у растений и беспозвоночных посредством инсерционного мутагенеза и инсерционной активации, Использование транспозонов у позвоночных было ограничено из-за отсутствия транспозонов, специфичных для позвоночных. Почти все транспозоны, совместимые с геномами позвоночных и присутствующие в них, неактивны и часто относят к «мусорной» ДНК. Однако можно идентифицировать неактивные транспозоны и искусственно воссоздавать их в качестве активных агентов. Исследователи-генетики Жужанна Изсвак и Золтан Ивичс обнаружили последовательность транспозона рыбы, которая, несмотря на то, что она бездействовала в течение 15 миллионов лет, могла быть возрождена в качестве вектора для введения чужеродных генов в геномы позвоночных, включая геномы человека. Этот транспозон, получивший название «Спящая красавица», был описан в 1997 году, и его можно было искусственно реактивировать в функционирующий транспозон.

«Спящая красавица» также может быть жизнеспособной в процедурах генной терапии, помогая ввести полезные трансгены в геномы хозяина. Belcher et al. проверили это понятие, используя транспозоны "Спящей красавицы", чтобы помочь ввести последовательности мышам с серповидно-клеточной анемией, чтобы они могли производить ферменты, необходимые для противодействия их анемии. Belcher et al. начали свой эксперимент с создания генетической последовательности, состоящей из мобильного элемента Hmox-1 и транспозазы из "Спящей красавицы". Затем эту последовательность добавляли, вставляли в плазмиду и вводили в клетки мышей. Транспозаза от Sleeping Beauty помогла вставить транспозон Hmox-1 в геном мышей, что позволило производить фермент гемоксигеназу-1 (HO-1). У мышей, которым вводили вставку, наблюдалось пятикратное увеличение экспрессии HO-1, что, в свою очередь, уменьшало закупорку кровеносных сосудов из-за серповидно-клеточной анемии. Публикация эксперимента в 2010 году показала, что транспозоны могут быть полезны в генной терапии.

Природные P-элементы содержат:

• кодирующая последовательность для фермента транспозаза ;
• последовательности распознавания для действия транспозазы.

Транспозаза - это фермент, который регулирует и катализирует удаление элемента P из ДНК хозяина, разрезая на двух сайтах узнавания, а затем повторно вставляет элемент P случайным образом. Это процесс случайной вставки, который может влиять на существующие гены или нести дополнительный ген, который может использоваться в качестве процесса для генетических исследований.

Чтобы использовать этот процесс как полезный и управляемый генетический инструмент, две части элемента P должны быть разделены, чтобы предотвратить неконтролируемое перемещение. Поэтому нормальными генетическими инструментами являются:

• ДНК, кодирующая транспозазу (или иногда просто транспозазу) без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться; и
• «плазмида P».

Плазмиды P всегда содержат:

• репортерный ген дрозофилы, часто маркер красных глаз (продукт гена white);
• последовательности распознавания транспозазы;

и могут содержать:

• представляющий интерес ген;
• и E. репортерный ген coli (часто своего рода антибиотик резистентность); и
• источник репликации и другие связанные плазмидные «домашние» последовательности.

Методы использования (Drosophila)

(методы прямой генетики) Есть два основных пути использовать эти инструменты: Трансформация мухи и Вставной мутагенез, каждый из которых описан ниже.

Трансформация мухой

(в надежде на вставку в некодирующие области)

1. Микроинъекция заднего конца ранней стадии (пре-клеточность) эмбриона с кодированием транспозазы и плазмиды с репортерным геном, представляющим интерес геном и последовательностями распознавания транспозазы.
2. Происходит случайная транспозиция, вставляя интересующий ген и репортерный ген.
3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы устранить генетические различия между клетками организма. (Только некоторые клетки организма будут трансформированы. При селекции передается только генотип гамет, удаляя эту вариацию).
4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. Они несут вставленный интересующий ген, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за интересующего гена.

Важно отметить, что вставленный ген мог нарушить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.

Инсерционный мутагенез

(надеясь на вставку в кодирующую область)

1. Микроинъекция эмбриона с кодированием транспозазы и плазмида с репортерным геном и последовательностями распознавания транспозазы (и часто E. coli репортерный ген и начало репликации и т. д.).
2. Происходит случайная транспозиция, случайным образом вставляя репортерный ген. Вставка, как правило, происходит рядом с активно транскрибируемыми генами, поскольку именно здесь структура хроматина наиболее рыхлая, поэтому ДНК наиболее доступна.
3. Выращивайте мух и скрещивайте их, чтобы удалить генетические вариации между клетками организм (см. выше).
4. Ищите мух, экспрессирующих репортерный ген. В них произошла успешная транспозиция, поэтому их можно исследовать для определения фенотипа из-за мутации существующих генов.

Возможные мутации:

1. Вставка в транслируемую область =>гибридный белок / усеченный белок. Обычно вызывает потерю функции белка, хотя наблюдаются более сложные эффекты.
2. Вставка в интрон =>измененный сплайсинг шаблон / сбой сплайсинга. Обычно приводит к усечению белка или образованию неактивных неправильно сплайсированных продуктов, хотя обычно наблюдаются более сложные эффекты.
3. Вставка в 5 '(последовательность, которая станет 5' UTR мРНК) нетранслируемой области =>усечение стенограмма. Обычно приводит к тому, что мРНК не содержит 5 'cap, что приводит к менее эффективной трансляции.
4. Вставка в промотор =>снижение / полная потеря экспрессии. Всегда приводит к значительному снижению уровня производства протеина. Наиболее полезный тип вставки для анализа из-за простоты ситуации.
5. Вставка между промотором и вышестоящими энхансерами =>потеря функции энхансера / захват функции энхансера для репортерного гена. † Обычно снижает уровень белка специфичность к типу клеток, хотя часто наблюдаются сложные эффекты.

† Захват энхансера

Захват энхансера из другого гена позволяет анализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, может использоваться для картирования экспрессии мутированного гена в организме и является очень мощным инструментом.

Другое использование P-элементов (Drosophila)

(метод обратной генетики)

Вторичная мобилизация

Если есть старый P-элемент рядом с геном Интерес (со сломанной транспозазой) можно ремобилизовать с помощью микроинъекции эмбриона с кодированием транспозазы или самой транспозазы. Элемент P часто перемещается в пределах нескольких килобаз от исходного местоположения, надеясь, что это повлияет на интересующий вас ген, как на «Insertional Mutagenisis».

Анализ продуктов мутагенеза (Drosophila)

После определения функции мутировавшего белка можно секвенировать / очистить / клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:

Обратная ПЦР

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, с помощью ПЦР.

1. Изолируйте геном мухи.
2. Пройдите легкий гидролиз (используя фермент [фермент 1], который, как известно, НЕ вырезан в репортерном гене), давая фрагменты в несколько килобаз, некоторые из которых содержат вставку и ее фланкирующую ДНК.
3. Самолигируют расщепленный (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), давая выбор кольцевых фрагментов ДНК, некоторые со вставкой и ее фланкирующей ДНК.
4. Разрежьте плазмиды в некоторой точке репортерного гена (ферментом [ферментом 2], который, как известно, очень редко разрезает геномную ДНК, но, как известно, в репортерный ген).
5. Используя праймеры для секций репортерного гена, ДНК можно амплифицировать для секвенирования.

Процесс разрезания, самолигирования и повторное разрезание позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив участок разреза [фермента 1].

Спасение плазмиды (трансформация E. coli)

Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, с помощью спасения плазмиды.

1. Изолировать геном мухи.
2. Пройдите легкий переваривание (используя фермент [фермент 1], который, как известно, разрезает границу между репортерным геном и репортерным геном E. coli и плазмидными последовательностями), давая фрагменты в несколько килобаз, некоторые с репортером E. coli, плазмидными последовательностями и его фланкирующими ДНК.
3. Самолигируйте гидролизат (низкая концентрация ДНК для обеспечения самолигирования), давая выборку кольцевых фрагментов ДНК, некоторые из которых содержат репортер E. coli, плазмидные последовательности и ее фланкирующую ДНК.
4. Вставьте плазмиды в клетки E. coli (например, электропорацией).
5. Скрининг плазмид на предмет репортерного гена E. coli. Только успешные вставки плазмид с последовательностями «домашнего хозяйства» плазмиды будут экспрессировать этот ген.

7. Ген можно клонировать для дальнейшего анализа.

Геномы других организмов можно анализировать аналогичным образом, хотя и с другими мобильными элементами. Недавнее открытие «транспозона моряка » (из реконструкции исходной последовательности из многих «мертвых» версий в геноме человека) позволило провести множество новых экспериментов, у моряка есть хорошо законсервированные гомологи в широком диапазоне видов и является очень универсальным инструментом.

В эту статью включены материалы из статьи Citizendium «Транспозоны как генетический инструмент », на которую распространяется лицензия Creative Непортированная лицензия Commons Attribution-ShareAlike 3.0, но не в рамках GFDL.