Войти
Р- элементы - это мобильные элементы, которые были обнаружены у дрозофилы как возбудители генетических признаков, называемых гибридным дисгенезом. Транспозонов отвечает за P черта P элемента и встречается только у диких мух. Они также встречаются у многих других эукариот.
Элемент P кодирует транспозазу протеина P. В отличие от самок лабораторных штаммов, самки дикого типа, как полагают, также экспрессируют ингибитор функции Р- транспозазы из того же самого элемента. Этот ингибитор уменьшает нарушение генома, вызванное элементами P, позволяя воспроизводить потомство. Доказательства этого получены при скрещивании лабораторных самок (у которых отсутствует ингибитор Р- транспозазы) с самцами дикого типа (которые имеют Р- элементы). В отсутствие ингибитора элементы P могут пролиферировать по всему геному, нарушая многие гены и убивая потомство.
Р- элементы обычно используются в качестве мутагенных агентов в генетических экспериментах с дрозофилой. Одним из преимуществ этого подхода является то, что мутации легко обнаружить. При гибридном дисгенезе один штамм дрозофилы спаривается с другим штаммом дрозофилы, давая гибридное потомство и вызывая хромосомные повреждения, которые, как известно, являются дисгенными. Гибридная дисгенезия требует участия обоих родителей. Например, в системе PM, где штамм P вносит вклад по отцовской линии, а штамм M - по материнской, может происходить дисгенезия. Обратное скрещивание с отцом-цитотипом M и матерью P дает нормальное потомство, поскольку оно скрещивается по способам P x P или M x M. P- мужские хромосомы могут вызывать дисгенезию при скрещивании с самками M.
Элемент P является транспозоном класса II и перемещается по основанному на ДНК механизму «вырезать и вставить». Последовательность состоит из 4 экзонов с 3 интронами. Полный сплайсинг интронов производит фермент транспозазу, в то время как альтернативный частичный сплайсинг интронов 1 и 2, оставляющий только интрон 3, кодирует репрессор P- элемента. Полный автономный P- элемент кодирует фермент транспозазу, который распознает концевые инвертированные повторы из 31 п.н. P- элемента и катализирует удаление и повторную вставку P- элемента. Полный элемент - 2907 п.н.; неавтономные P- элементы содержат внутреннюю делецию различной длины, которая отменяет продукцию транспозазы, но такие элементы все еще могут быть мобилизованы, если транспозаза кодируется в другом месте генома. Вставка P- элемента и последующее вырезание приводит к образованию прямых повторов из 8 пар оснований, и присутствие таких повторов указывает на предыдущую активность P- элемента.
Все P- элементы имеют каноническую структуру, содержащую концевые инвертированные повторы из 31 п.о. и внутренние инвертированные повторы из 11 п.н., расположенные в THAP-домене транспозазы. Более короткие и самые длинные P- элементы являются неавтономными элементами. Самые длинные элементы P кодируют транспозазу, необходимую для транспозиции. Элемент P также кодирует супрессор транспозиции, который накапливается в цитоплазме во время развития клеток. Таким образом, при скрещивании самца P или M с самкой P цитоплазма самки содержит супрессор, который связывается с любыми P- элементами и предотвращает их транспозицию.
Гибридный гонад относится к высокой скорости мутации в зародышевой линии клеток дрозофилы штаммов в результате от скрещивания самцов с автономными P элементов ( P штамма / P cytotype) и у женщин, которые испытывают недостаток P элементов ( М штамма / М cytotype). Синдром гибридного дисгенеза характеризуется зависящей от температуры стерильностью, повышенным уровнем мутаций, а также увеличением хромосомной перестройки и рекомбинации.
На фенотип гибридного дисгенеза влияет транспозиция Р- элементов внутри клеток зародышевой линии потомства самцов штамма Р от самок штамма М. Транспозиция происходит только в клетках зародышевой линии, потому что событие сплайсинга, необходимое для образования мРНК транспозазы, не происходит в соматических клетках.
Гибридный дисгенез проявляется при скрещивании самцов линии Р с самками линии М, а не при скрещивании самок линии Р (самок с автономными элементами Р) с самцами линии М. Яйца самок штамма P содержат большое количество белка- репрессора, который предотвращает транскрипцию гена транспозазы. Яйца матерей штамма M, которые не содержат репрессорный белок, допускают транспозицию P- элементов из спермы отцов. У самок штамма P репрессоры находятся в цитоплазме. Следовательно, когда самцы штамма P оплодотворяют самок штамма M (чья цитоплазма не содержит репрессора), самец вносит в свой геном элемент P, но не цитоплазму самца, что приводит к потомству штамма P.
Этот эффект способствует тому, что piRNAs наследуются только по материнской линии, что обеспечивает механизм защиты от P- элементов.
Элемент P нашел широкое применение в исследованиях дрозофилы в качестве мутагена. В системе мутагенеза обычно используются автономный, но неподвижный элемент и мобильный неавтономный элемент. Затем мух последующих поколений можно проверить с помощью фенотипа или ПЦР. Встречающиеся в природе элементы P содержат кодирующую последовательность для фермента транспозазы и последовательности распознавания для действия транспозазы. Транспозаза регулирует и катализирует удаление P- элемента из ДНК-хозяина, разрезая два сайта узнавания, а затем случайным образом повторно вставляя. Это случайная вставка, которая может мешать существующим генам или нести дополнительный ген, который можно использовать для генетических исследований.
Чтобы использовать это как полезный и управляемый генетический инструмент, две части элемента P должны быть разделены, чтобы предотвратить неконтролируемую транспозицию. Нормальные генетические инструменты - это ДНК, кодирующая транспозазу без последовательностей распознавания транспозазы, поэтому она не может вставляться, и « Р плазмида». Р- плазмиды всегда содержат репортерный ген дрозофилы, часто маркер красных глаз (продукт гена white) и последовательности распознавания транспозаз. Они могут содержать интересующий ген, ген селектируемого маркера E. coli, часто какой-то вид устойчивости к антибиотикам, начало репликации или другие связанные плазмидные «домашние» последовательности.
Эти инструменты можно использовать двумя способами:
Вставленный ген мог нарушить функцию одного из генов хозяина. Требуется несколько линий мух, чтобы можно было провести сравнение и убедиться, что никакие дополнительные гены не были выбиты.
Возможные мутации:
Захват энхансера из другого гена позволяет анализировать функцию этого энхансера. Это, особенно если репортерный ген предназначен для флуоресцентного белка, можно использовать для картирования экспрессии мутированного гена в организме и является очень мощным инструментом. Это полезный инструмент для изучения паттернов экспрессии генов (во времени и в пространстве).
Эти методы называются обратной генетикой. Обратная генетика - это подход к обнаружению функции гена путем анализа фенотипических эффектов конкретных последовательностей генов, полученных путем секвенирования ДНК.
После определения функции мутированного белка можно секвенировать / очистить / клонировать области, фланкирующие вставку, следующими методами:
Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, с помощью ПЦР. Основная статья: обратная ПЦР Процесс разрезания, самолигирования и повторного разрезания позволяет амплифицировать фланкирующие области ДНК без знания последовательности. Точку, в которой произошло лигирование, можно увидеть, определив участок разреза [фермента 1].
Процесс анализа ДНК, фланкирующей известную вставку, путем спасения плазмиды. 