Войти
Секретомика - это тип протеомики, который включает анализ секретома - все секретируемые белки клетки, ткани или организма. Секретируемые белки участвуют во множестве физиологических процессов, включая передачу сигналов и ремоделирование матрикса, но также являются неотъемлемой частью инвазии и метастазирования злокачественных клеток .. Таким образом, секретомика сыграла особенно важную роль в открытии биомаркеров для рака и понимании молекулярных основ патогенеза. Анализ нерастворимой фракции секретома (внеклеточный матрикс ) был назван матрисомикой.
В 2000 году Tjalsma et al. придумали термин «секретом» в своем исследовании эубактерий B. subtilis. Они определили секретом как все секретируемые белки и секреторные механизмы бактерий. Используя базу данных белковых последовательностей B. subtilis и алгоритм, который изучал сайты расщепления и аминоконцевые сигнальные пептиды, характерные для секретируемых белков, они смогли предсказать, какая часть протеома секретируется клеткой. В 2001 году та же лаборатория установила стандарт секретомики - прогнозов, основанных только на аминокислотной последовательности, недостаточно для определения секретома. Они использовали двумерный гель-электрофорез и масс-спектрометрию для идентификации 82 белков, секретируемых B. subtilis, только 48 из которых были предсказаны с использованием генома. метод их предыдущей статьи. Это демонстрирует необходимость проверки белков предсказанных результатов.
Поскольку была выявлена сложная природа секреторных путей, а именно то, что существует много неклассических путей секреции и есть много несекретируемых белков, которые являются частью классического секреторного пути - более глубокий определение секретома стало необходимым. В 2010 году Agrawal et al. предложил определять секретом как «глобальную группу секретируемых белков во внеклеточное пространство клеткой, тканью, органом или организмом в любой момент времени и в любых условиях посредством известных и неизвестных секреторных механизмов с участием конститутивных и регулируемых секреторных органелл».
В культуре клетки окружены контаминантами. Бычья сыворотка из сред для культивирования клеток и клеточного мусора может загрязнять набор секретируемых белков, используемый для анализа. Загрязняющие вещества крупного рогатого скота представляют собой особую проблему, поскольку белковые последовательности многих внеклеточных белков крупного рогатого скота, таких как фибронектин и фибулин-1, аналогичны последовательностям белков человека. Для удаления этих примесей клетки можно промыть PBS или бессывороточной средой (SFM) перед инкубацией в SFM и сбором секретируемых белков. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не лопнуть клетки, высвобождая внутриклеточные белки. Кроме того, необходимо оптимизировать время и условия инкубации, чтобы метаболический стресс, который может быть вызван недостатком питательных веществ в SFM, не влиял на секретомный анализ.
Некоторые белки секретируются в небольшом количестве, а затем разводят дальше в среде для культивирования клеток или в жидкости организма, что затрудняет обнаружение и анализ этих белков. Могут использоваться методы концентрирования, такие как осаждение TCA, а также высокочувствительные методы, такие как микрочипы антител, которые могут обнаруживать даже отдельные молекулы белка.
Многие секретомные исследования проводятся in vitro методами культивирования клеток, но неясно, секретируются ли те же белки in vivo. Все больше и больше исследований, особенно изучающих секрет рака, используют методы in vivo для подтверждения актуальности результатов, полученных in vitro. Например, проксимальные биологические жидкости могут быть собраны рядом с опухолью для проведения секретомного анализа.
Многие секретируемые белки имеют N -концевая пептидная последовательность, которая сигнализирует транслируемому белку перемещаться в эндоплазматический ретикулум, где происходит процессинг, который в конечном итоге приведет к секреции. Присутствие этих сигнальных пептидов можно использовать для прогнозирования секретома клетки. Программное обеспечение, такое как SignalP, может идентифицировать сигнальные последовательности (и их сайты расщепления), чтобы предсказать секретируемые белки. Поскольку трансмембранные белки также обрабатываются в ER, но не секретируются, программное обеспечение, такое как сервер TMHMM, используется для прогнозирования трансмембранных доменов и, следовательно, исключения ложноположительных результатов. Некоторые секреторные белки не имеют последовательностей классических сигнальных пептидов. Эти «безлидерные секреторные белки» (LSP) будут упущены SignalP. SecretomeP - это программа, которая была разработана, чтобы попытаться предсказать эти неклассические секреторные белки по их последовательностям. Полногеномные секретомы были предсказаны для широкого круга организмов, включая человека, мышь, рыбок данио и сотни бактерий.
Методы полногеномного предсказания имеют множество проблем. Высока вероятность ложных срабатываний и ложноотрицательных результатов. Кроме того, на экспрессию гена сильно влияют условия окружающей среды, а это означает, что секретом, предсказанный на основе генома или библиотеки кДНК, вряд ли полностью совпадет с истинным секретомом. Протеомные подходы необходимы для проверки любых предсказанных секретируемых белков.
Доступно несколько общегеномных баз данных секретомов или баз знаний, основанных как на курировании, так и на компьютерном прогнозировании. Эти базы данных включают базу данных секретома грибов (FSD), базу знаний секретома грибов (FunSecKB) и базу данных секретома молочнокислых бактерий. Также недавно были выпущены база данных субклеточного местоположения белков человека и животных (MetaSecKB ) и база данных субклеточного протеома протистов (ProtSecKB ). Хотя в расчетном прогнозе есть некоторые неточности, эти базы данных предоставляют полезные ресурсы для дальнейшей характеристики субклеточного расположения белков.
Масс-спектрометрический анализ является неотъемлемой частью секретомики. Сыворотка или супернатант, содержащие секретированные белки, переваривают протеазой, и белки разделяют методами 2D гель-электрофореза или хроматографией. Затем каждый отдельный белок анализируется с помощью масс-спектрометрии, и сгенерированный отпечаток массы пептида может быть обработан через базу данных для идентификации белка.
Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) стал важным методом секретомики - он помогает различать секретируемые белки и контаминанты бычьей сыворотки в культуре клеток. Супернатант клеток, выращенных в нормальной среде, и клеток, выращенных в среде с аминокислотами, меченными стабильными изотопами, смешивают в соотношении 1: 1 и анализируют с помощью масс-спектрометрии. Белковые примеси в сыворотке покажут только один пик, потому что они не имеют обозначенного эквивалента. Например, метод SILAC успешно использовался для различения белков, секретируемых человеческими хондроцитами в культуре, и контаминантами сыворотки.
Микроматрица антител - это высокочувствительный и высокопроизводительный метод для обнаружение белков, которое недавно стало частью секретомного анализа. Антитела или другой тип связывающей молекулы фиксируют на твердой подложке и добавляют смесь флуоресцентно меченых белков. Интенсивность сигнала используется для идентификации белков. Микроматрицы антител чрезвычайно универсальны - их можно использовать для анализа количества белка в смеси, различных изоформ белков, посттрансляционных модификаций и биохимической активности белков. Кроме того, эти микроматрицы очень чувствительны - они могут обнаруживать отдельные молекулы белка. В настоящее время микроматрицы антител используются в основном для анализа образцов плазмы человека, но также могут использоваться для культивирования клеток и секретомики биологических жидкостей, представляя простой способ поиска одновременного наличия множества белков.
Помимо того, что секретируемые белки важны для нормальных физиологических процессов, они также играют важную роль в туморогенезе через рост и миграцию клеток, инвазия и ангиогенез, что делает секретомику превосходным методом для открытия биомаркеров рака. Использование протеомного метода биологических жидкостей или сыворотки крови для идентификации биомаркеров может быть чрезвычайно трудным - биологические жидкости сложны и сильно изменчивы. Секретомный анализ линий раковых клеток или пораженных тканей представляет собой более простую и более конкретную альтернативу для открытия биомаркеров.
Двумя основными биологическими источниками секретомики рака являются супернатанты линий раковых клеток и проксимальные биологические жидкости, жидкости, контактирующие с опухоль. Супернатант линии раковых клеток является привлекательным источником секретируемых белков. Доступно множество стандартизированных клеточных линий, и супернатант гораздо проще анализировать, чем проксимальную жидкость тела. Но неясно, является ли секретом клеточной линии хорошим представлением реальной опухоли в ее специфическом микроокружении, а стандартизованная клеточная линия не иллюстрирует гетерогенность реальной опухоли. Анализ проксимальных жидкостей может дать лучшее представление о секретоме опухоли человека, но этот метод также имеет свои недостатки. Процедуры сбора проксимальных жидкостей все еще нуждаются в стандартизации, и необходимы доброкачественные контроли. Кроме того, экологические и генетические различия между пациентами могут усложнить анализ.
Секретомный анализ обнаружил новые потенциальные биомаркеры многих типов рака, включая рак легких, рак печени, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак простаты и рак груди. Простатоспецифический антиген (ПСА), текущий стандартный биомаркер рака простаты, имеет низкую диагностическую специфичность - уровни ПСА не всегда позволяют различить агрессивный и неагрессивный рак - поэтому крайне необходим лучший биомаркер. Используя секретомный анализ клеточных линий простаты, в одном исследовании было обнаружено несколько белков, обнаруженных в более высоких уровнях в сыворотке больных раком, чем в здоровой контрольной группе.
Также существует большая потребность в биомаркерах для обнаружения груди рак - в настоящее время биомаркеры существуют только для мониторинга более поздних стадий рака. Секретомный анализ клеточных линий рака молочной железы привел к открытию белка ALCAM как нового биомаркера с многообещающим диагностическим потенциалом.
Анализ секретома эмбриона человека может быть полезным при поиске неинвазивного метода определения жизнеспособности эмбрионов. В ЭКО эмбрионы оцениваются по морфологическим критериям в попытке найти эмбрионы с высоким имплантационным потенциалом. Поиск более количественного метода оценки может помочь уменьшить количество эмбрионов, используемых в ЭКО, тем самым уменьшив беременностей более высокого порядка. Например, в одном исследовании удалось разработать отпечатки секрета для многих бластоцист и было обнаружено 9 белков, которые могут различать бластоцисты с нормальным и ненормальным количеством хромосом. Этот тип анализа может помочь заменить доимплантационный генетический скрининг (PGS), который включает биопсию эмбриональных клеток и может быть вредным для развития.
