Войти
Принцип SILAC . Клетки по-разному маркируют, выращивая их в легкой среде с нормальным аргинином (Arg-0, синий цвет) или среде с тяжелым аргинином (Arg-6, красный цвет). Метаболическое включение аминокислот в белки приводит к массовому сдвигу соответствующих пептидов. Этот сдвиг массы может быть обнаружен с помощью масс-спектрометра, как показано на изображенных масс-спектрах. Когда оба образца объединены, соотношение интенсивностей пиков в масс-спектре отражает относительное содержание белка. В этом примере меченый белок имеет одинаковое количество в обоих образцах (соотношение 1). Мечение стабильных изотопов с помощью аминокислот в культуре клеток (SILAC ) - это метод, основанный на масс-спектрометрия, которая обнаруживает различия в содержании белка среди образцов с использованием нерадиоактивного изотопного мечения. Это популярный метод количественной протеомики.
Две популяции клеток культивируют в культуре клеток. Одну из популяций клеток кормили питательной средой, содержащей нормальные аминокислоты. Напротив, вторую популяцию кормят питательной средой, содержащей аминокислоты, меченные стабильными (нерадиоактивными) тяжелыми изотопами . Например, среда может содержать аргинин, меченный шестью атомами углерода-13 (C) вместо нормального углерода-12 (C). Когда клетки растут в этой среде, они включают тяжелый аргинин во все свои белки. После этого все пептиды, содержащие единственный аргинин, на 6 Да тяжелее, чем их нормальные аналоги. В качестве альтернативы можно использовать единообразную маркировку C или N. Уловка состоит в том, что белки из обеих популяций клеток можно объединить и проанализировать вместе с помощью масс-спектрометрии. Пары химически идентичных пептидов разного стабильного изотопного состава можно различить в масс-спектрометре по разнице в массах. Отношение интенсивностей пиков в масс-спектре для таких пар пептидов отражает соотношение распространенности для двух белков.
Подход SILAC, включающий включение тирозина, меченного девять углерод-13 атомов (C) вместо нормального углерода-12 (C) были использованы для изучения субстратов тирозинкиназы в сигнальных путях. SILAC стал очень мощным методом изучения клеточной передачи сигналов, посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование, межбелковое взаимодействие и регуляция экспрессии генов.. Кроме того, SILAC стал важным методом секретомики, глобального изучения секретируемых белков и секреторных путей. Его можно использовать для различения белков, секретируемых клетками в культуре, и загрязнителей сыворотки. Также были опубликованы стандартизованные протоколы SILAC для различных применений.
Хотя SILAC в основном использовался для изучения эукариотических клеток и культур клеток, недавно он был применен к бактериям и их многоклеточной биопленке в устойчивости к антибиотикам, чтобы дифференцировать толерантность. и чувствительные субпопуляции.
Pulsed SILAC (pSILAC) представляет собой вариант метода SILAC, при котором меченые аминокислоты добавляются в среду для выращивания только на короткий период времени. Это позволяет отслеживать различия в продукции белка de novo, а не в исходной концентрации.
Он также использовался для изучения толерантности биопленок к антибиотикам, чтобы дифференцировать толерантные и чувствительные субпопуляции
Традиционно уровень мультиплексирования в SILAC был ограничен из-за количества доступных изотопов SILAC. Недавно новый метод, названный NeuCode (кодирование нейтронов) SILAC, увеличил уровень мультиплексирования, достижимый с помощью метаболического мечения (до 4). Аминокислотный метод NeuCode похож на SILAC, но отличается тем, что при маркировке используются только тяжелые аминокислоты. Использование только тяжелых аминокислот устраняет необходимость 100% включения аминокислот, необходимых для SILAC. Повышенная способность аминокислот NeuCode к мультиплексированию является результатом использования дефектов массы от дополнительных нейтронов в стабильных изотопах. Однако эти небольшие различия в массе необходимо разрешить с помощью масс-спектрометров высокого разрешения.
