Войти
Компартментализация in vitro (IVC ) на основе эмульсии технология, которая создает клеточные компартменты in vitro. Эти компартменты сконструированы таким образом, что каждый содержит не более одного гена. Когда ген транскрибируется и / или транслируется, его продукты (РНК и / или белки ) становятся «захваченными» кодирующей ген внутри отсека. За счет связывания генотипа (ДНК ) и фенотипа (РНК, белок) компартментализация делает возможным выбор и эволюцию фенотипа.
Метод компартментализации in vitro был впервые разработан Tawfik et al. Основываясь на идее, что дарвиновская эволюция основана на связи генотипа с фенотипом, Tawfik et al. разработали водные компартменты эмульсий вода-в-масле (в / м) для имитации клеточных компартментов, которые могут связывать генотип и фенотип. Эмульсии клеточно-подобных компартментов были образованы путем добавления реакционной смеси in vitro транскрипции / трансляции к перемешиваемому минеральному маслу, содержащему поверхностно-активные вещества. Средний диаметр капель, измеренный с помощью лазерной дифракции, составил 2,6 мкм. В качестве доказательства концепции Tawfik el al. разработали эксперимент, который мог бы транскрибировать и транслировать ген M. HaeIII в присутствии 107-кратного избытка генов, кодирующих другой фермент folA. 3 ’каждого гена были специально сконструированы так, чтобы содержать последовательности R / M HaeIII, и когда метилтрансфераза HaeIII экспрессировалась из гена M.HaeIII, она метилировала последовательность R / M HaeIII и приводила к устойчивости гена к перевариванию рестриктазой. Путем отбора последовательностей ДНК, которые выживают при расщеплении эндонуклеазами, Tawfik el al. обнаружили, что было обогащение генов M.HaeIII, то есть в 1000 раз в первом раунде отбора.
Рис. 1. Компартментализация in vitro: цикл отбора Эмульсии вода-в-масле (в / м) создаются путем смешивания водной и масляной фаз с помощь поверхностно-активных веществ. Типичная эмульсия IVC образуется сначала путем создания смеси масло-поверхностно-активное вещество путем перемешивания, а затем постепенного добавления водной фазы к смеси масло-поверхностно-активное вещество. Для образования стабильной эмульсии необходима смесь HLB (гидрофильно-липофильный баланс) и поверхностно-активных веществ с низким HLB. Некоторые комбинации поверхностно-активных веществ, используемых для создания смеси масло-поверхностно-активное вещество, включают минеральное масло / 0,5% Tween 80 / 4,5% Span 80 / дезоксихолат натрия и более термостойкую версию, легкое минеральное масло / 0,4% Tween 80 / 4,5 % Диапазон 80 / 0,05% Triton X-100. Водная фаза, содержащая компоненты транскрипции и / или трансляции, медленно добавляется к масляным поверхностно-активным веществам, и образование в / м облегчается гомогенизацией, перемешиванием или использованием ручного устройства для экструзии.
Качество эмульсии можно определить методами световой микроскопии и / или динамического светорассеяния. Эмульсия весьма разнообразна, и более высокие скорости гомогенизации помогают производить более мелкие капли с более узким распределением по размерам. Однако скорость гомогенизации необходимо контролировать, поскольку скорость более 13 500 об / мин имеет тенденцию приводить к значительной потере активности фермента на уровне транскрипции. Наиболее широко используемое образование эмульсии дает капли со средним диаметром 2-3 мкм и средним объемом ~ 5 фемтолитров, или 10 капель воды на мл эмульсии. Отношение генов к каплям рассчитано таким образом, что большинство капель статистически содержат не более одного гена.
IVC позволяет миниатюризировать крупномасштабные методы, которые теперь могут быть выполнены в микромасштабе, включая сопряженную in vitro транскрипцию и перевод (IVTT) эксперименты. Оптимизация и интеграция транскрипции и перевода позволяет быстро и легко контролировать экспериментальные проекты. IVTT можно проводить как в объемных эмульсиях, так и в микрокаплях с использованием микрофлюидики на основе капель. Микрокапли, капли в масштабе от пико до фемтолитров, успешно использовались в качестве сосудов для одиночных молекул ДНК. Эта капельная технология позволяет проводить высокопроизводительный анализ с множеством различных давлений отбора в одной экспериментальной установке. IVTT в микрокаплях предпочтительнее, когда сверхэкспрессия желаемого белка будет токсичной для клетки-хозяина, сводя к минимуму полезность механизмов транскрипции и трансляции.
IVC использовала экстракты бактериальных клеток, зародышей пшеницы и ретикулоцитов кролика (RRL) для транскрипция и перевод. Также возможно использовать восстановленную бактериальную систему трансляции, такую как PURE, в которой компоненты трансляции очищаются индивидуально, а затем объединяются. При экспрессии эукариотических или сложных белков желательно использовать эукариотические системы трансляции, такие как экстракт зародышей пшеницы или более совершенная альтернатива, экстракт RRL. Чтобы использовать RRL для транскрипции и трансляции, нельзя использовать традиционный состав эмульсии, поскольку он отменяет трансляцию. Вместо этого была разработана новая рецептура эмульсии: 4% Abil EM90 / легкое минеральное масло, и было продемонстрировано, что они способны экспрессировать люциферазу и теломеразу человека.
После завершения транскрипции и / или трансляции в каплях эмульсия будет разрушена последовательными этапами удаления минерального масла и поверхностно-активных веществ, чтобы сделать возможным последующий отбор. На этом этапе крайне важно иметь метод, позволяющий «отслеживать» продукты каждого гена до кодирующего гена, когда они становятся свободно плавающими в гетерогенной популяции молекул. Существует три основных подхода к отслеживанию каждого фенотипа до его генотипа. Первый метод заключается в присоединении к каждой молекуле ДНК группы биотина и дополнительной кодирующей последовательности для стрептавидина (СТАБИЛЬНЫЙ дисплей). Все вновь образованные белки / пептиды будут в слиянии с молекулами стрептавидина и связываться с их биотинилированной кодирующей последовательностью. Усовершенствованная версия прикрепляла две молекулы биотина к концам молекулы ДНК для увеличения авидности между молекулой ДНК и пептидами, слитыми со стрептавидином, и использовала синтетический ген стрептавидина с низким содержанием GC для повышения эффективности и специфичности во время ПЦР-амплификации.. Второй метод - ковалентно связать ДНК и белок. Были продемонстрированы две стратегии. Первый заключается в формировании слитых белков M.HaeIII. Каждый экспрессируемый белок / полипептид будет в слиянии с ДНК-метилтрансферазным доменом Hae III, который способен ковалентно связываться с фрагментами ДНК, содержащими последовательность 5'-GGC * -3 ', где C * представляет собой 5-фтор-2 дезоксицитидин. Вторая стратегия - использовать мономерный мутант фермента VirD2. Когда белок / пептид экспрессируется в слиянии с белком VirD2 Agrobacterium, он будет связываться со своей кодирующей последовательностью ДНК, которая имеет одноцепочечный выступ, содержащий последовательности узнавания Т-границы VirD2. Третий метод - связать фенотип и генотип с помощью бусинок. Используемые гранулы будут покрыты стрептавидином, чтобы обеспечить связывание биотинилированной ДНК, кроме того, гранулы также будут отображать родственного партнера по связыванию с аффинной меткой, который будет экспрессироваться в слиянии с белком / пептидом.
В зависимости от выбранного фенотипа будут использоваться стратегии разностного отбора. Стратегию отбора можно разделить на три основные категории: отбор для связывания, отбор для катализа и отбор для регулирования. Выбираемый фенотип может варьироваться от РНК до пептида и белка. При отборе для связывания наиболее часто развивающимися фенотипами являются пептиды / белки, обладающие избирательным сродством к конкретному антителу или молекуле ДНК. Примером является отбор белков, которые обладают сродством к ДНК цинкового пальца, Sepp et al. При отборе каталитических белков / РНК обычно выделяют новые варианты с новыми или улучшенными ферментативными свойствами. Например, были отобраны новые варианты рибозима с транс-лигазной активностью, которые показали множественные обороты. Путем выбора для регулирования можно выбрать ингибиторы нуклеаз ДНК, такие как белковые ингибиторы ДНКазы колицина E7.
По сравнению с другими технологиями отображения in vitro, IVC имеет два основных преимущества. Первое преимущество - это способность контролировать реакции внутри капель. Гидрофобные и гидрофильные компоненты могут быть доставлены в каждую каплю поэтапно без нарушения химической целостности капли, и, таким образом, путем контроля того, что и когда добавлять, можно контролировать реакцию в каждой капле. Кроме того, в зависимости от характера реакции, которую необходимо провести, можно также изменить pH каждой капли. Совсем недавно использовались фотоклетки, и их участие в реакции регулировалось фотоактивацией. Второе преимущество состоит в том, что IVC позволяет выбирать каталитические молекулы. Например, Griffiths et al. был способен отобрать варианты фосфотриэстеразы с более высоким K cat путем определения образования продукта и количества с помощью антител против продукта и проточной цитометрии соответственно.
