A Раскручивающий элемент ДНК (DUE или DNAUE ) - это сайт инициации для открытия структуры двойной спирали ДНК в ориджине репликации для синтеза ДНК. Он богат АТ и легко денатурируется из-за своей низкой спиральной стабильности, что позволяет распознавать однонитевую область комплексом распознавания источника.
DUE обнаруживаются как в прокариотах, так и в эукариотические организмы, но впервые были обнаружены Хуанг Ковальски в происхождении дрожжей и бактерий. Раскручивание ДНК обеспечивает доступ репликационной машине к новым одиночным цепям. У эукариот DUE являются сайтом связывания белков, связывающих элемент, раскручивающий ДНК (DUE-B), необходимых для инициации репликации. У прокариот DUE обнаруживаются в форме тандемных консенсусных последовательностей, фланкирующих 5'-конец связывающего домена DnaA. Акт раскручивания у этих богатых А-Т элементов происходит даже в отсутствие каких-либо связывающих белков происхождения из-за отрицательных сил сверхспирализации, что делает его энергетически благоприятным действием. DUE обычно находятся в 30-100 п.н. репликации.
Специфическое раскручивание DUE обеспечивает сборку комплекса инициации в сайт репликации на одноцепочечной ДНК, как обнаружил Хуанг Ковальски. ДНК-геликаза и связанные с ней ферменты теперь могут связываться с развернутой областью, создавая репликационную вилку start. Раскручивание этой области дуплексных цепей связано с низким потреблением свободной энергии из-за спиральной нестабильности, вызванной специфическими взаимодействиями стэкинга оснований, в сочетании с противодействием суперспирализации. Отрицательная суперспирализация позволяет ДНК оставаться стабильной при плавлении за счет снижения напряжения скручивания. Обнаруживается в источниках репликации как бактерий, так и дрожжей, а также присутствует у некоторых млекопитающих. Длина составляет от 30 до 100 п.н.
У прокариот большую часть времени репликация ДНК происходит из одной единственной точки начала репликации на одной единственной цепи последовательности ДНК. Независимо от того, является ли этот геном линейным или кольцевым, у бактерий есть собственный механизм, необходимый для репликации.
У бактерий белок DnaA является инициатором репликации. Он загружается в oriC в последовательности DnaA-бокса, где связывает и собирает филаменты для открытия дуплекса и рекрутирования DnaB-геликазы с помощью DnaC. DnaA является высококонсервативным и имеет два ДНК-связывающих домена. Прямо перед этим блоком DnaA находятся три тандемных 13-мерных последовательности. Эти тандемные последовательности, обозначенные L, M, R от 5 'до 3', являются бактериальными DUE. Две из трех из этих богатых А-Т областей (M и R) раскручиваются при связывании DnaA с DnaA-боксом через непосредственную близость к раскручивающемуся дуплексу. Последняя 13-мерная последовательность L, наиболее удаленная от этого ящика DnaA, в конечном итоге разворачивается после того, как геликаза DnaB окружает ее. Это формирует репликационный пузырь для продолжения репликации ДНК.
Археи используют более простой гомолог эукариотического комплекса распознавания ориджина, чтобы найти начало репликации в последовательностях, называемых блоком распознавания ориджина ( ORB).
Раскручивание этих трех DUE является необходимым шагом для начала репликации ДНК. Отдаленное притяжение от плавления дуплекса в последовательности бокса DnaA - это то, что вызывает дальнейшее плавление на сайтах M и R DUE. Затем более удаленный сайт L разворачивается за счет связывания DnaB. Раскручивание этих 13-мерных сайтов не зависит от oriC-связывающих белков. Это образование отрицательной суперспирализации, которое вызывает раскручивание.
Скорости раскручивания ДНК в трех E.coli DUE были экспериментально сравнены с помощью спектроскопии ядерного резонанса. В физиологических условиях эффективность раскрытия каждой из последовательностей, богатых А-Т, отличалась друг от друга. Во многом из-за различных отдаленно окружающих последовательностей.
Кроме того, было обнаружено, что плавление пар оснований AT / TA происходит намного быстрее, чем плавление пар GC / CG (15–240 с против ~ 20 с). Это подтверждает идею о том, что последовательности АТ эволюционно отдают предпочтение в элементах DUE из-за их простоты раскручивания.
Три 13-мерные последовательности, идентифицированные как DUE в E.coli, хорошо подходят -сохраняется в начале репликации всех задокументированных кишечных бактерий. Общая консенсусная последовательность была получена посредством сравнения консервативных бактерий с образованием последовательности из 11 оснований. E.coli содержит 9 оснований из 11 консенсусной последовательности в своем oriC внутри 13-мерных последовательностей. Эти последовательности обнаруживаются исключительно в единственной точке начала репликации; нигде больше в последовательности генома.
Механизмы репликации эукариот работают примерно так же, как у прокариот, но находятся под более тонкой регулировкой. Необходимо убедиться, что каждая молекула ДНК реплицируется только один раз и что это происходит в нужном месте в нужное время. Действует в ответ на внеклеточные сигналы, координирующие начало деления, по-разному от ткани к ткани. Внешние сигналы запускают репликацию в S-фазе за счет продукции циклинов, которые активируют циклин-зависимые киназы (CDK) с образованием комплексов.
Репликация ДНК у эукариот начинается при привязка комплекса распознавания происхождения (ORC) к источнику. Это происходит в G1фазе ячейки, служащей для продвижения цикла ячейки вперед в S-фазу. Это связывание позволяет дальнейшему связыванию факторов с образованием пререпликативного комплекса (пре-RC). Пре-RC запускается, чтобы инициироваться, когда с ним связываются циклин-зависимая киназа (CDK) и Dbf4-зависимая киназа (DDK). Затем инициирующие комплексы позволяют рекрутировать активатор геликазы MCM Cdc45 и последующее раскручивание дуплекса в ориджине.
Репликация у эукариот инициируется в нескольких сайтах последовательности, образуя несколько репликационных вилок одновременно. Эта эффективность требуется для больших геномов, которые им необходимо реплицировать.
У эукариот нуклеосомные структуры могут затруднять инициацию репликации. Они могут блокировать доступ DUE-B к DUE, тем самым подавляя инициацию транскрипции. Может помешать скорости. Однако линейная природа эукариотической ДНК по сравнению с прокариотической кольцевой ДНК позволяет легче раскрутить ее дуплекс после того, как она была должным образом размотана из нуклеосомы. Активность DUE можно модулировать факторами транскрипции, такими как ABF1.
Распространенной модельной системой дрожжей, которая хорошо представляет репликацию эукариот, является Saccharomyces cerevisiae. Он содержит автономно реплицирующиеся последовательности (ARS), которые трансформируются и хорошо сохраняются в плазмиде. Некоторые из этих ARS действуют как источники репликации. Эти ARS состоят из трех доменов A, B и C. Домен A - это место, где находится согласованная последовательность ARS, созданная для ACS. Домен B содержит DUE. Наконец, домен C необходим для облегчения белок-белковых взаимодействий. Было обнаружено, что ARS распределены по 16 хромосомам и повторяются каждые 30-40 т.п.н.
У разных видов эти последовательности ARS вариабельны, но их домены A, B и C хорошо законсервированы. Любые изменения в DUE (домен B) вызывают снижение общей функции ARS в целом при инициации репликации. Это было обнаружено в ходе исследований с использованием иминообмена и ЯМР-спектроскопии.
DUE, обнаруженные на сегодняшний день в некоторых репликационных источниках у млекопитающих. В общем, очень мало источников репликации у млекопитающих было хорошо проанализировано, поэтому трудно определить, насколько распространены DUE в их определенных источниках репликации.
Клетки человека по-прежнему очень мало детализируют свое происхождение. Известно, что репликация инициируется в больших областях зоны инициации, связанных с известными белками, такими как ген c-myc и β-глобин. Те, у кого DUE, как считается, действуют почти так же, как дрожжевые клетки.
DUE в происхождении плазмид в клетках млекопитающих, SV40, как обнаружено, связан с гексамером T-ag, который вводит противоположная суперспирализация для увеличения благоприятности раскручивания цепи.
Млекопитающие с DUE продемонстрировали способность к структурообразованию, которая обеспечивает стабильность однонитевой размотанной ДНК. К ним относятся крестообразные, внутримолекулярные триплексы и др.
белки раскручивающихся элементов ДНК (DUE-Bs) обнаружены у эукариот.
Они действуют, чтобы инициировать разделение цепей путем связывания с DUE. Гомологи последовательности DUE-B обнаружены у различных видов животных - рыб, амфибий и грызунов. DUE-B имеют неупорядоченные C-концевые домены, которые связываются с DUE путем распознавания этого C-конца. Никакая другая специфичность последовательности не участвует в этом взаимодействии. Подтверждено индуцированием мутаций по длине последовательности DUE-B, но во всех случаях способность к димеризации остается неизменной. После связывания ДНК С-конец становится упорядоченным, что придает большую устойчивость против деградации протеазы . Всего DUE-B состоит из 209 остатков, 58 из которых неупорядочены до связывания с DUE. DUE-B гидролизует АТФ, чтобы функционировать. Также обладают последовательностью, аналогичной аминоацил-тРНК-синтетазе, и ранее были классифицированы как таковые. DUE-B образуют гомодимеры, которые создают расширенную бета-лист вторичную структуру, проходящую через него. Два из этих гомодимеров объединяются, чтобы сформировать общую асимметричную структуру DUE-B.
При образовании пре-RC Cdc45 локализуется в DUE для активности посредством взаимодействия с DUE-B. Обеспечение раскручивания дуплекса и инициации репликации.
У человека DUE-B на 60 аминокислот длиннее, чем его дрожжевые ортологи аналоги. Оба локализованы в основном в ядре.
Уровни DUE-B находятся в постоянном количестве, независимо от клеточного цикла. Однако в S-фазе DUE-B могут временно фосфорилироваться для предотвращения преждевременной репликации. Активность DUE-B контролируется ковалентно. Сборка этих DUE-B в областях DUE зависит от локальной активности киназы и фосфатазы. DUE-B также могут подавляться миРНК и участвовать в расширенных стадиях G1.
Мутации, нарушающие раскручивание на сайтах DUE напрямую препятствует активности репликации ДНК. Это может быть результатом делеций / изменений в области DUE, добавления реактивных реагентов или добавления специфической нуклеазы . Однако сайты DUE относительно нечувствительны к точечным мутациям, сохраняя свою активность при изменении оснований в сайтах связывания белков. Во многих случаях активность DUE можно частично восстановить путем повышения температуры. Может быть восстановлен путем повторного добавления сайта DUE.
Если существует достаточно серьезная мутация DUE, из-за которой он больше не привязан к DUE-B, Cdc45 не может связываться и не будет связываться с c фактор транскрипции -myc. Это может быть восстановлено в связанных с заболеванием (ATTCT) (n) увеличениях длины последовательности DUE. Если активность DUE восстанавливается в избытке, это может вызвать нарушение регуляции образования ориджина и прогрессирование клеточного цикла.
У эукариот, когда DUE-B выбиты, клетка не переходит в S-фазу своего цикла, где происходит репликация ДНК.. Результатом станет усиление апоптоза. Но активность может быть уменьшена путем повторного добавления DUE-B, даже от другого вида. Это потому, что DUE-B гомологичны между видами. Например, если DUE-B в яйце Xenopus мутированы, репликация ДНК не произойдет, но ее можно сохранить, добавив HeLa DUE-B для восстановления полной функциональности.