Войти
Снимок экрана приложения CaspLab Comet Assay Анализ одноклеточного гель-электрофореза (SCGE, также известный как кометный анализ ) - несложный и чувствительный метод обнаружения повреждения ДНК на уровне отдельной эукариотической клетки. Впервые он был разработан Östling Johansson в 1984 году, а затем модифицирован Сингхом и др. в 1988. С тех пор он стал популярным как стандартный метод оценки повреждений / репарации ДНК, биомониторинга и тестирования генотоксичности. Он включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, лизис клеток в нейтральных или щелочных (pH>13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. Термин «комета» относится к модели миграции ДНК через гель для электрофореза, который часто напоминает комету.
Анализ кометы (электрофорез в одноклеточном геле) представляет собой простой метод измерения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) разрывы цепи в эукариотических клетках. Клетки, внедренные в агарозу на предметном стекле микроскопа, лизируют детергентом и высоким содержанием соли с образованием нуклеоидов, содержащих суперспиральные петли ДНК, связанные с ядерным матриксом. Электрофорез при высоком pH приводит к образованию структур, напоминающих кометы, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии; Интенсивность кометного хвоста относительно головы отражает количество разрывов ДНК. Вероятно, причиной этого является то, что петли, содержащие разрыв, теряют свою сверхспиральность и могут свободно расширяться к аноду. Затем следует визуальный анализ с окрашиванием ДНК и вычислением флуоресценции для определения степени повреждения ДНК. Это может быть выполнено вручную или автоматически с помощью программного обеспечения для визуализации.
Образец клеток, полученных либо из in vitro клеточную культуру или от испытуемого in vivo диспергируют в отдельные клетки и суспендируют в расплавленной легкоплавкой агарозе при 37 ° C. Эту моновуспензию отливают на предметное стекло микроскопа. Стекло покровное стекло держат под углом, и моновспензию наносят на точку контакта между покровным стеклом и предметным стеклом. Когда покровное стекло опускается на предметное стекло, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Агароза превращается в гель при 4 ° C и покровное стекло удаляется.
Агароза образует матрицу из углеводных волокон, которые инкапсулируют клетки, закрепляя их на месте. Агароза считается осмотической -нейтральной, поэтому растворы могут проникать в гель и воздействовать на клетки без изменения положения клеток.
В исследовании in vitro клетки будут подвергаться воздействию тестируемого агента - обычно УФ-свет, ионизирующее излучение или генотоксичное химическое вещество. - вызвать повреждение ДНК в инкапсулированных клетках. Для калибровки обычно используется перекись водорода, чтобы обеспечить стандартизованный уровень повреждения ДНК.
Затем слайды погружают в раствор, который вызывает лизис клеток. Лизирующий раствор, часто используемый в анализе комет, состоит из высококонцентрированной водной соли (часто может использоваться обычная поваренная соль ) и детергента (например, Тритон Х-100 или саркозинат ). pH лизирующего раствора можно регулировать (обычно от нейтрального до щелочного pH) в зависимости от типа повреждения, которое исследует исследователь.
Водная соль разрушает белки и их структуру связывания внутри клетки, а также нарушает содержание РНК в клетке. Детергент растворяет клеточные мембраны. Под действием лизирующего раствора клетки разрушаются. Все белки, РНК, мембраны и цитоплазматические и нуклеоплазматические составляющие разрушаются и диффундируют в матрикс агарозы. Остается только ДНК клетки, которая распадается, заполняя полость в агарозе, которую прежде заполняла вся клетка. Эта структура называется нуклеоидом (общий термин для структуры, в которой сосредоточена ДНК).
После лизиса клеток (обычно от 1 до 2 часов при 4 ° C) слайды промывают дистиллированной водой для удаления всех солей и погружают в второй раствор - раствор для электрофореза . Опять же, этот раствор можно регулировать pH в зависимости от типа исследуемого повреждения.
Предметные стекла оставляют на ~ 20 минут в растворе для электрофореза перед приложением электрического поля. В щелочных условиях двойная спираль ДНК денатурируется, и нуклеоид становится одноцепочечным.
Приложено электрическое поле (обычно 1 V /cm ) в течение ~ 20 минут. Затем слайды нейтрализуют до pH 7, окрашивают ДНК-специфическим флуоресцентным красителем и анализируют с помощью микроскопа с прикрепленной ПЗС (устройство с зарядовой связью - по сути, это цифровая камера ), подключенная к компьютеру с программным обеспечением анализа изображений.
Концепция, лежащая в основе анализа SCGE, заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоорганизованную ассоциацию с матричными белками в ядре. При повреждении эта организация нарушается. Отдельные нити ДНК теряют свою компактную структуру и расслабляются, расширяясь из полости в агарозу. При приложении электрического поля ДНК, которая имеет общий отрицательный заряд, притягивается к положительно заряженному аноду. Неповрежденные нити ДНК слишком велики и не покидают полость, тогда как чем меньше фрагменты, тем дальше они могут свободно перемещаться за определенный период времени. Таким образом, количество ДНК, которая покидает полость, является мерой степени повреждения ДНК в клетке.
Анализ изображения измеряет общую интенсивность флуоресценции для всего нуклеоида и флуоресценцию мигрировавшей ДНК и сравнивает два сигнала. Чем сильнее сигнал от перемещенной ДНК, тем больше повреждений. Общая структура напоминает комету (отсюда «кометный анализ») с круглой головкой, соответствующей неповрежденной ДНК, которая остается в полости, и хвостом поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем выше уровень повреждений.
Кометный анализ - это универсальный метод обнаружения повреждений, который с корректировкой протокола может быть использован для количественной оценки наличия большого количества разнообразных повреждений ДНК (повреждений). Обычно выявляются разрывы одинарных и двойных нитей. Иногда утверждается, что щелочные условия и полная денатурация ДНК необходимы для обнаружения разрывов одной нити. Однако это не так, как одно-, так и двухцепочечные разрывы также обнаруживаются в нейтральных условиях. Однако в щелочных условиях дополнительные структуры ДНК обнаруживаются как повреждение ДНК: AP-сайты (абазические сайты, в которых отсутствует пиримидин или пурин нуклеотид ) и участков, где происходит эксцизионная репарация.
Анализ комет является чрезвычайно чувствительным анализом повреждений ДНК. С этой чувствительностью нужно обращаться осторожно, поскольку она также уязвима для физических изменений, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов. По сути, следует избегать всего, что может вызвать повреждение или денатурацию ДНК, за исключением исследуемых факторов. Наиболее распространенной формой анализа является щелочная версия, хотя пока нет окончательного протокола щелочного анализа. Благодаря простой и недорогой настройке его можно использовать в условиях, когда недоступны более сложные анализы.
К ним относятся тестирование генотоксичности, биомониторинг человека и молекулярная эпидемиология, экогенотоксикология, а также фундаментальные исследования повреждений и восстановления ДНК.
Кометный анализ может определить степень фрагментации ДНК в сперматозоидах. Степень фрагментации ДНК была связана с результатами экстракорпорального оплодотворения.
Комета была модифицирована для использования со сперматозоидами в качестве инструмента диагностики мужского бесплодия
Для разрушения этих прочно связанных протаминов. белки, чтобы использовать комету для сперматозоидов, требуются дополнительные шаги в протоколе деконденсации.
