Войти
Система доставки частиц PDS-1000 / He В ge генетическая инженерия, генная пушка или система доставки биолистических частиц - это устройство, используемое для доставки экзогенной ДНК (трансгенов ), РНК или белок для клеток. Покрывая частицы тяжелого металла представляющим интерес геном и стреляя этими микрочастицами в клетки с использованием механической силы, можно вызвать интеграцию желаемой генетической информации в клетки. Методика, связанная с такой доставкой ДНК микрочастицами, часто называется биолистикой .
. Это устройство способно трансформировать практически любой тип клетки и не ограничивается трансформацией ядра; он также может трансформировать органеллы, включая пластиды и митохондрии.
. Генная пушка используется для доставки экзогенной ДНК в клетки. Этот метод известен как «биолистика». Генные пушки можно эффективно использовать на большинстве клеток, но в основном они используются на клетках растений. Шаг 1 Аппарат генной пушки готов к стрельбе. Шаг 2 Гелий заполняет камеру, и давление на разрывную мембрану увеличивается. Шаг 3 Давление в конечном итоге достигает точки, где разрывной диск разрывается, и возникающий в результате выброс гелия толкает макроноситель, покрытый ДНК / золотом («Пластиковый диск»), в стопорный экран. Шаг 4 Когда макроноситель попадает в стопорный экран, покрытые ДНК частицы золота продвигаются через экран в клетки-мишени. Изначально генная пушка была пневматическим пистолетом Кросмана , модифицированным для стрельбы плотными частицами вольфрама. Его изобрели Джон С. Сэнфорд, Эд Вольф и Нельсон Аллен из Корнельского университета вместе с Тедом Кляйном из DuPont в период с 1983 по 1986 год. лук (выбранный из-за их большого размера клетки), и устройство использовали для доставки частиц, покрытых маркером геном, который будет передавать сигнал, если произойдет правильная вставка транскрипта ДНК. Генетическая трансформация была продемонстрирована при наблюдаемой экспрессии маркерного гена в луковых клетках.
Самые ранние генные пушки, изготовленные на заказ (изготовленные Нельсоном Алленом), использовали гвоздь 22 калибра гвоздь патрон для приведения полиэтиленового цилиндра (пули) в пулю Дугласа 22 калибра. бочка. Капля вольфрамового порошка, покрытая генетическим материалом, помещалась на пулю и сбивалась в чашку Петри ниже. Пуля приварилась к диску под пластиной Петри, и генетический материал попал в образец с эффектом пончика, включающим разрушение в середине образца с кольцом хорошей трансформации по периферии. Пушка была подключена к вакуумному насосу и во время стрельбы находилась под вакуумом. Ранний дизайн был запущен в ограниченное производство на Rumsey-Loomis (местный механический цех тогда на Мекленбург-роуд в Итаке, штат Нью-Йорк, США).
Biolistics, Inc продала Dupont права на производство и распространение обновленного устройства с улучшениями, включая использование гелия в качестве невзрывоопасного топлива и многодисковый механизм доставки столкновения для минимизации повреждений для образцов тканей. Другие тяжелые металлы, такие как золото и серебро, также используются для доставки генетического материала, причем золото более предпочтительно из-за более низкой цитотоксичности по сравнению с вольфрамовыми носителями снарядов.
Биолистическая трансформация включает интеграцию функционального фрагмента ДНК - известного как конструкция ДНК - в клетки-мишени. Генная конструкция представляет собой кассету ДНК, содержащую все необходимые регуляторные элементы для правильной экспрессии в организме-мишени. Хотя генные конструкции могут различаться по своей конструкции в зависимости от желаемого результата процедуры трансформации, все конструкции обычно содержат комбинацию последовательности промотора, последовательности терминатора , представляющего интерес гена и репортерный ген.
Промотор:
Промоторы контролируют расположение и величину экспрессии гена и действуют как «рулевое колесо и педаль газа» для гена. Промоторы предшествуют интересующему гену в конструкции ДНК и могут быть изменены в лабораторных условиях для точной настройки экспрессии трансгена. Промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты является примером обычно используемого промотора, который приводит к устойчивой конститутивной экспрессии генов в растениях.
Терминатор:
Терминаторные последовательности необходимы для правильной экспрессии генов и размещаются после кодирующей области интересующего гена в конструкции ДНК. Обычным терминатором для биолистической трансформации является терминатор NOS, полученный из Agrobacterium tumefaciens. Из-за высокой частоты использования этого терминатора в генно-инженерных растениях были разработаны стратегии для обнаружения его присутствия в пищевых продуктах для отслеживания несанкционированных генетически модифицированных культур.
Репортерный ген:
Ген, кодирующий селективный маркер, является общий элемент в конструкциях ДНК, который используется для отбора правильно трансформированных клеток. Выбор селектируемого маркера будет зависеть от трансформируемого вида, но обычно это будет ген, наделяющий клетки способностью детоксикации для определенных гербицидов или антибиотиков, таких как канамицин, гигромицин B или глифосат.
Дополнительные элементы:
Необязательные компоненты конструкции ДНК включают такие элементы, как последовательности cre-lox, которые позволяют контролируемое удаление конструкции из целевого генома. Такие элементы выбираются разработчиком конструкции для выполнения специализированных функций наряду с основным представляющим интерес геном.
Генные пушки в основном используются с растительными клетками. Тем не менее, его можно использовать и для людей, и для других животных.
Мишенью генной пушки часто является каллус недифференцированных растительных клеток или группа незрелых зародышей, растущих на гелевой среде в чашке Петри. После того, как покрытые ДНК частицы золота были доставлены в клетки, ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции (временная экспрессия), а иногда она интегрируется в хромосому растения («стабильная» трансформация)
Если доставленная конструкция ДНК содержит селектируемый маркер, то стабильно трансформированные клетки могут быть отобраны и культивированы с использованием методов культивирования тканей. Например, если доставленная конструкция ДНК содержит ген, который придает устойчивость к антибиотику или гербициду, то можно выбрать стабильно трансформированные клетки путем включения этого антибиотика или гербицида в среду для тканевой культуры.
Трансформированные клетки можно обрабатывать рядом растительных гормонов, таких как ауксины и гиббереллины, и каждый из них может делиться и дифференцироваться в организованные специализированные тканевые клетки. целого растения. Эта возможность полной регенерации называется тотипотентностью. Новое растение, возникшее из успешно трансформированной клетки, может иметь новые наследственные черты. Использование генной пушки можно противопоставить использованию Agrobacterium tumefaciens и его плазмиды Ti для вставки ДНК в клетки растений. См. трансформация для получения информации о различных методах трансформации у разных видов.
Генные пушки также использовались для доставки ДНК-вакцин.
Доставка плазмид в нейроны крысы с использованием генной пушки, в частности нейронов DRG, также используется в качестве фармакологического предшественника при изучении эффектов нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
Генная пушка стала обычным инструментом для маркировки подмножеств клеток в культивируемой ткани. Помимо способности трансфицировать клетки ДНК-плазмидами, кодирующими флуоресцентные белки, генная пушка может быть адаптирована для доставки в клетки широкого спектра жизненно важных красителей.
Бомбардировка генной пушки также использовалась для преобразование Caenorhabditis elegans в качестве альтернативы микроинъекции.
Биолистика оказалась универсальным методом генетической модификации, и ее обычно предпочитают создавать -устойчивые культуры, такие как злаки. Примечательно, что Bt кукуруза является продуктом биолистики. Трансформация пластид также показала большой успех при бомбардировке частицами по сравнению с другими современными методами, такими как трансформация, опосредованная Agrobacterium, которая затрудняет нацеливание вектора на хлоропласт и стабильную экспрессию в нем. Кроме того, нет сообщений о том, что хлоропласт подавляет трансген, вставленный с помощью генной пушки. Кроме того, всего за один выстрел из генной пушки квалифицированный техник может создать два трансформированных организма. Эта технология даже позволила модифицировать определенные ткани in situ, хотя это может повредить большое количество клеток и трансформировать только некоторые, а не все клетки ткани.
Biolistics случайным образом вводит ДНК в клетки-мишени. Таким образом, ДНК может быть трансформирована в любые геномы, присутствующие в клетке, будь то ядерные, митохондриальные, плазмидные или любые другие, в любой комбинации, хотя правильная конструкция конструкции может смягчить это. Доставка и интеграция нескольких матриц конструкции ДНК - отличная возможность, приводящая к потенциально переменным уровням экспрессии и количеству копий встроенного гена. Это происходит из-за способности конструкций отдавать и брать генетический материал от других конструкций, в результате чего одни не несут трансген, а другие несут множественные копии; количество вставленных копий зависит как от того, сколько копий трансгена имеет вставленная конструкция, так и от того, сколько было вставлено. Кроме того, поскольку эукариотические конструкции полагаются на незаконную рекомбинацию - процесс, посредством которого трансген интегрируется в геном без аналогичных генетических последовательностей, - а не на гомологичную рекомбинацию, они не могут быть нацелены в определенные места. внутри генома, если трансген не доставляется совместно с реагентами.
