Войти
Стилизованный вид карбоксисомы и связанных с ней структур бактерий, таких как Микрокомпартменты утилизации пропандиола (Pdu) и утилизации этаноламина (Eut). Различные гексамерные белки оболочки BMC, выполняющие разные функции в оболочке, показаны разными оттенками синего цвета. Пентамерные вершинные белки показаны пурпурным цветом. Инкапсулированные ферменты показаны зеленым цветом и расположены слоями. [Изображение: Т. Йейтс] Бактериальные микрокомпартменты (BMC ) представляют собой органеллы -подобные структуры, состоящие из белковой оболочки, которая включает ферменты и другие белки. BMC обычно имеют диаметр около 40–200 нанометров и полностью состоят из белков. Оболочка функционирует как мембрана, поскольку она избирательно проницаема. Другие белковые компартменты, обнаруженные у бактерий и архей, включают нанокомпоненты инкапсулина и газовые везикулы.
Первые BMC были обнаружены в 1950-х годах на электронных микрофотографиях цианобактерий, и позже были названы карбоксисомами в честь их роли в углеродной фиксации. До 1990-х годов карбоксисомы считались необычным явлением, присущим некоторым автотрофным бактериям. Но затем гены, кодирующие белки, гомологичные таковым из карбоксисомной оболочки, были идентифицированы в оперонах pdu (утилизация пропандиола) и eut (утилизация этаноламина) . Впоследствии электронные микрофотографии в просвечивающем свете клеток Salmonella, выращенных на пропандиоле или этаноламине, показали присутствие многогранных тел, подобных карбоксисомам. Термин «метаболома» используется для обозначения таких катаболических BMC (в отличие от автотрофной карбоксисомы).
Хотя карбоксисомы, BMC, использующие пропандиол (PDU) и этаноламин (EUT), инкапсулируют разные ферменты и, следовательно, выполняют разные функции, гены, кодирующие белки оболочки, очень похожи. Большинство генов (кодирующих белки оболочки и инкапсулированные ферменты) из экспериментально охарактеризованных BMC расположены рядом друг с другом в различных генетических локусах или оперонах. В настоящее время секвенировано более 20000 бактериальных геномов, и методы биоинформатики могут использоваться для поиска всех генов оболочки BMC и изучения других генов поблизости, создавая список потенциальных BMC. В 2014 году комплексное исследование выявило 23 различных локуса, кодирующих до 10 функционально различных BMC в 23 бактериальных типах.
Оболочка BMC выглядит икосаэдрический или квазиикосаэдрический, и образован субъединицами (псевдо) гексамерного и пентамерного белка.
Три типа белков (BMC-H, BMC-T и BMC-P), которые, как известно, образуют оболочку BMC. Инкапсулированные ферменты / белки (показаны пурпурным, красным и бирюзовым) составляют последовательность метаболических реакций. Основными составляющими оболочки BMC являются белки, содержащие домен (ы) Pfam00936. Эти белки образуют олигомеры гексагональной формы, которые, как считается, образуют грани оболочки.
Белки BMC-H, которые содержат единственная копия домена Pfam00936, являются наиболее распространенным компонентом фасеток оболочки. Были определены кристаллические структуры ряда этих белков, показывающие, что они собираются в циклические гексамеры, обычно с небольшой порой в центре. Предполагается, что это отверстие участвует в избирательном транспорте небольших метаболитов через оболочку.
Подмножество белков оболочки состоит из тандемных (слитых) копий домена Pfam00936 (белки BMC-T). Структурно охарактеризованные белки BMC-T образуют тримеры, которые имеют псевдогексамерную форму. Некоторые кристаллические структуры BMC-T показывают, что тримеры могут складываться лицом к лицу. В таких структурах одна пора от одного тримера находится в «открытой» конформации, а другая - в закрытой, что позволяет предположить, что может существовать механизм, похожий на воздушный шлюз, который модулирует проницаемость некоторых оболочек BMC. Другая подгруппа белков BMC-T содержит кластер [4Fe-4S] и может участвовать в транспорте электронов через оболочку BMC.
Двенадцать пятиугольников необходимы, чтобы покрыть вершины икосаэдрической оболочки. Кристаллические структуры белков семейства EutN / CcmL (Pfam03319) были решены, и они обычно образуют пентамеры (BMC-P). Важность белков BMC-P в формировании оболочки, по-видимому, различается для разных BMC. Было показано, что они необходимы для формирования оболочки PDU BMC, поскольку мутанты, у которых был удален ген белка BMC-P, не могут образовывать оболочки, но не для альфа-карбоксисомы: без белков BMC-P карбоксисомы все еще будет собираться, и многие из них имеют удлиненную форму; эти мутантные карбоксисомы кажутся «протекающими».
Хотя оболочка BMC архитектурно похожа на многие вирусные капсиды, белки оболочки не обнаруживают имеют любую структурную или последовательную гомологию с белками капсида. Вместо этого сравнение структур и последовательностей предполагает, что и BMC-H (и BMC-T), и BMC-P, скорее всего, произошли от истинных клеточных белков, а именно, сигнального белка PII и белка, содержащего OB-складчатый домен, соответственно. Геометрия BMC-мембраны представляет собой многогранник, объяснение которого объясняется рассмотрением многокомпонентных оболочек.
Хорошо известно, что ферменты упакованы внутри оболочки BMC и что некоторая степень метаболита и кофактора секвестрация должна произойти. Тем не менее, другие метаболиты и кофакторы также должны проходить через оболочку для функционирования BMC. Например, в карбоксисомах рибулозо-1,5-бисфосфат, бикарбонат и фосфоглицерат должны проходить через оболочку, в то время как диффузия диоксида углерода и кислорода явно ограничена. Точно так же для PDU BMC оболочка должна быть проницаемой для пропандиола, пропанола, пропионилфосфата и, возможно, также для витамина B12, но ясно, что пропиональдегид каким-то образом изолирован, чтобы предотвратить повреждение клеток. Есть некоторые свидетельства того, что АТФ также должен проходить через некоторые оболочки BMC.
Было высказано предположение, что центральная пора, образованная в гексагональных белковых плитках оболочки, является каналом, по которому метаболиты диффундируют в оболочку. Например, поры в оболочке карбоксисомы имеют общий положительный заряд, который, как предполагалось, привлекает отрицательно заряженные субстраты, такие как бикарбонат. В микрокомпартменте PDU эксперименты по мутагенезу показали, что поры белка оболочки PduA являются путем проникновения субстрата пропандиола. Для более крупных метаболитов очевиден стробирующий механизм в некоторых белках BMC-T. В микрокомпартменте EUT закрытие большой поры в белке оболочки EutL регулируется присутствием основного метаболического субстрата, этаноламина.
Присутствие кластеров железо-сера в некоторых белках оболочки, предположительно в центральной части поры, привело к предположению, что они могут служить каналом, по которому электроны могут перемещаться через оболочку.
Недавний всесторонний обзор данных последовательности микробного генома показал до десяти различные метаболические функции, инкапсулированные оболочками BMC. Большинство из них участвует либо в связывании углерода (карбоксисомы), либо в окислении альдегидов (метаболосомы).
Общая схема функций для экспериментально охарактеризованных КМС. (А) Карбоксисомы. (B) Метаболосома. Реакции, выделенные серым цветом, - это периферические реакции на основной химический состав BMC. Олигомеры белков оболочки BMC изображены слева: синий - BMC-H; голубой, BMC-T; желтый, BMC-P. 3-PGA, 3-фосфоглицерат и RuBP, рибулозо-1,5-бисфосфат. 
Электронные микрофотографии, показывающие альфа-карбоксисомы из хемоавтотрофной бактерии Halothiobacillus neapolitanus : (A) расположены внутри клетки, и (B) неповреждены после изоляции. Шкала показывает 100 нм. Карбоксисомы инкапсулируют рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу / оксигеназу (RuBisCO) и карбоангидразу в углерод-фиксирующих бактериях как часть механизма концентрирования углерода. Бикарбонат закачивается в цитозоль и диффундирует в карбоксисому, где карбоангидраза превращает его в диоксид углерода, субстрат RuBisCO. Считается, что карбоксисомная оболочка слабо проницаема для углекислого газа, что приводит к эффективному увеличению концентрации углекислого газа вокруг RuBisCO, тем самым усиливая фиксацию углерода. Мутанты, у которых отсутствуют гены, кодирующие оболочку карбоксисом, демонстрируют фенотип, требующий высокого содержания углерода, из-за потери концентрации диоксида углерода, что приводит к усилению фиксации кислорода RuBisCO. Оболочки также были предложены для ограничения диффузии кислорода, тем самым предотвращая реакцию оксигеназы, уменьшая неэффективное фотодыхание.
Электронная микрофотография клетки Synechococcus elongatus PCC 7942, показывающая карбоксисомы в виде многогранных темных структур. Шкала показывает 500 нм. В дополнение к анаболическим карбоксисомам было охарактеризовано несколько катаболических BMC, которые участвуют в гетеротрофном метаболизме через короткоцепочечные альдегиды; все вместе они называются метаболосомами.
Эти BMC имеют общий инкапсулированный химический состав, управляемый тремя основными ферментами: альдегиддегидрогеназой, алкогольдегидрогеназой и фосфотрансацилазой. Поскольку альдегиды могут быть токсичными для клеток и / или летучими, считается, что они изолированы внутри метаболосомы. Альдегид первоначально связывается с коферментом А с помощью НАД + -зависимой альдегиддегидрогеназы, но эти два кофактора должны быть переработаны, поскольку они, по-видимому, не могут пересечь оболочку. Эти реакции рециркуляции катализируются алкогольдегидрогеназой (НАД +) и фосфотрансацетилазой (кофермент А), в результате чего образуется фосфорилированное ацильное соединение, которое легко может быть источником фосфорилирования на уровне субстрата или вступать в центральный метаболизм, в зависимости от того, растет ли организм. аэробно или анаэробно. Похоже, что большинство, если не все, метаболосомы используют эти основные ферменты. Метаболосомы также инкапсулируют другой фермент, который специфичен для исходного субстрата BMC, который генерирует альдегид; это считается сигнатурным ферментом BMC.
Электронная микрофотография клетки Escherichia coli, экспрессирующей гены PDU BMC (слева), и очищенных PDU BMC из того же штамма (справа). Некоторые бактерии могут использовать 1,2-пропандиол в качестве источника углерода. Они используют BMC для инкапсуляции нескольких ферментов, используемых в этом пути (Sampson and Bobik, 2008). PDU BMC обычно кодируется локусом 21 гена. Этих генов достаточно для сборки BMC, поскольку они могут быть трансплантированы от одного типа бактерии к другому, что приводит к функциональной метаболосоме у реципиента. Это пример биоинженерии, который также предоставляет доказательства в поддержку гипотезы эгоистичного оперона. 1,2-пропандиол дегидратируется до пропиональдегида пропандиолдегидратазой, которая требует витамина B12 в качестве кофактора. Пропионовый альдегид вызывает мутации ДНК и, как результат, токсичен для клеток, что, возможно, объясняет, почему это соединение блокируется внутри BMC. Конечными продуктами PDU BMC являются пропанол и пропионилфосфат, который затем дефосфорилируется до пропионата, образуя один АТФ. Пропанол и пропионат можно использовать в качестве субстратов для роста.
BMC с использованием этаноламина (EUT) кодируются во многих различных типах бактерий. Этаноламин расщепляется на аммиак и ацетальдегид под действием этаноламин-аммиачной лиазы, которая также требует витамина B12 в качестве кофактора. Ацетальдегид довольно летуч, и было обнаружено, что мутанты с дефицитом оболочки BMC имеют дефект роста и выделяют избыточное количество ацетальдегида. Было высказано предположение, что секвестрация ацетальдегида в метаболосоме предотвращает его потерю из-за летучести. Конечными продуктами EUT BMC являются этанол и ацетилфосфат. Этанол, вероятно, является источником потерянного углерода, но ацетилфосфат может либо генерировать АТФ, либо рециклироваться в ацетил-КоА и вступать в цикл TCA или в несколько биосинтетических путей.
Некоторые бактерии, особенно из рода Listeria, кодируют один локус, в котором присутствуют гены как PDU, так и EUT BMC. Пока не ясно, действительно ли это химерный BMC со смесью обоих наборов белков или образуются два отдельных BMC.
Было идентифицировано несколько различных BMC-локусов, которые содержат глицилрадикальные ферменты, которые получают каталитический радикал в результате расщепления s-аденозилкобаламина. Было показано, что один локус GRM у Clostridium phytofermentans участвует в ферментации фукозы и рамнозы, которые изначально разлагаются до 1,2-пропандиола в анаэробных условиях. Предполагается, что фермент радикального глицила дегидратирует пропандиол до пропионового альдегида, который затем обрабатывается способом, идентичным каноническому PDU BMC.
Отдельные линии происхождения Planctomycetes и Веррукомикробия кодирует локус BMC. Было показано, что локус в Planctomyces limnophilus участвует в аэробной деградации фукозы и рамнозы. Считается, что альдолаза вырабатывает лактальдегид, который затем обрабатывается через BMC, в результате чего получают 1,2-пропандиол и лактилфосфат.
Два типа Локусы BMC наблюдались у представителей родов Rhodococcus и Mycobacterium, хотя их фактическая функция не была установлена. Однако на основании охарактеризованной функции одного из генов, присутствующих в локусе, и предсказанных функций других генов, было высказано предположение, что эти локусы могут участвовать в деградации амино-2-пропанола. Альдегид, образующийся в этом предсказанном пути, будет чрезвычайно токсичным соединением метилглиоксалем; его секвестрация в BMC может защитить клетку.
Один тип локуса BMC не содержит RuBisCO или каких-либо основных ферментов метаболосомы, и было предложено для облегчения третьей категории биохимических превращений (т.е. не фиксации углерода или окисления альдегидов). Присутствие генов, кодирующих амидогидролазы и дезаминазы, может указывать на то, что этот BMC участвует в метаболизме азотистых соединений.
Путь сборки бета -карбоксисомы, и начинается с белка CcmM, образующего ядро RuBisCO. CcmM имеет два домена: N-концевой домен гамма-карбоангидразы, за которым следует домен, состоящий из трех-пяти повторов последовательностей, подобных малой субъединице RuBisCO. С-концевой домен объединяет RuBisCO, вероятно, за счет замены реальных малых субъединиц RuBisCO в голоферменте L8-S8, эффективно перекрестно связывая RuBisCO в клетке в один большой агрегат, называемый прокарбоксисомой. N-концевой домен CcmM физически взаимодействует с N-концевым доменом белка CcmN, который, в свою очередь, рекрутирует субъединицы гексагонального белка оболочки через инкапсулирующий пептид на его C-конце. Затем карбоксисомы пространственно выравниваются в цианобактериальной клетке посредством взаимодействия с бактериальным цитоскелетом, обеспечивая их равное распределение в дочерних клетках.
Сборка альфа-карбоксисом может отличаться от сборки бета-карбоксисом, поскольку они не имеют гомологичных белков к CcmN или CcmM и без инкапсулирующих пептидов. Пустые карбоксисомы наблюдались на электронных микрофотографиях. Некоторые микрофотографии показывают, что их сборка происходит как одновременное слияние ферментов и белков оболочки, в отличие от, казалось бы, ступенчатого способа, наблюдаемого для бета-карбоксисом. Было показано, что для образования простых альфа-карбоксисом в гетерологичных системах необходимы только большая и малая субъединицы Rubisco, внутренний заякоренный белок CsoS2 и основной белок оболочки CsoS1A.
Сборка метаболосом - это вероятно, подобен таковому у бета-карбоксисомы за счет начальной агрегации белков, которые необходимо инкапсулировать. Основные белки многих метаболосом агрегируются, когда экспрессируются по отдельности. Более того, многие инкапсулированные белки содержат концевые удлинения, которые поразительно похожи на С-концевой пептид CcmN, который рекрутирует белки оболочки. Эти пептиды инкапсуляции короткие (около 18 остатков), и предполагается, что они образуют амфипатические альфа-спирали. Было показано, что некоторые из этих спиралей опосредуют инкапсуляцию нативных ферментов в BMC, а также гетерологичных белков (таких как GFP).
За исключением карбоксисом, Во всех протестированных случаях BMC кодируются оперонами, которые экспрессируются только в присутствии их субстрата.
BMC PDU в Salmonella enterica индуцируются присутствием пропандиола или глицерина в анаэробных условиях и только пропандиола в аэробных условиях. Эта индукция опосредуется глобальными белками-регуляторами Crp и ArcA (воспринимающими циклический AMP и анаэробные условия соответственно) и регуляторным белком PocR, который является активатором транскрипции как для локусов pdu, так и для локусов cob (оперон, необходимый для синтеза витамина B12, необходимый кофактор для пропандиолдегидратазы).
BMC EUT в Salmonella enterica индуцируются через регуляторный белок EutR одновременным присутствием этаноламина и витамина B12, что может происходить в аэробных или анаэробных условиях. Salmonella enterica может производить эндогенный витамин B12 только в анаэробных условиях, хотя он может импортировать цианобаламин и преобразовывать его в витамин B12 либо в аэробных, либо в анаэробных условиях.
BMC PVM в Planctomyces limnophilus индуцируются присутствием фукозы или рамнозы в аэробных условиях, но не глюкозой. Аналогичные результаты были получены для GRM BMC из Clostridium phytofermentans, для которого оба сахара индуцируют гены, кодирующие BMC, а также гены, кодирующие диссимиляционные ферменты фукозы и рамнозы.
Помимо охарактеризованных регуляторных систем, биоинформатика исследования показали, что потенциально существует множество других регуляторных механизмов, даже в пределах функционального типа BMC (например, PDU), включая двухкомпонентные регуляторные системы.
Карбоксисомы присутствуют во всех цианобактериях и многих других фото- и хемоавтотрофных бактериях. Цианобактерии являются глобально значимыми факторами фиксации углерода, и, поскольку в текущих атмосферных условиях для этого требуются карбоксисомы, карбоксисомы являются основным компонентом глобальной фиксации диоксида углерода.
Несколько типов BMC вовлечены в вирулентность патогенов, таких как Salmonella enterica и Listeria monocytogenes. Гены BMC, как правило, активизируются в условиях вирулентности, и их мутация приводит к дефекту вирулентности, о чем свидетельствуют конкурентные эксперименты.
Некоторые особенности BMC делают их привлекательными для биотехнологических приложений. Поскольку карбоксисомы увеличивают эффективность фиксации углерода, много исследований было направлено на внедрение карбоксисом и потребовало переносчиков бикарбоната в хлоропласты растений, чтобы с определенным успехом разработать механизм концентрирования CO2 в хлоропласте.
В более общем плане, потому что белки оболочки BMC Самостоятельно собираемые пустые корпуса могут быть сформированы, что требует усилий по их проектированию, чтобы вместить индивидуальный груз. Обнаружение инкапсулирующего пептида на концах некоторых белков, связанных с BMC, дает возможность начать конструировать собственные BMC путем слияния чужеродных белков с этим пептидом и совместной экспрессии его с белками оболочки. Например, добавив этот пептид к пируватдекарбоксилазе и алкогольдегидрогеназе, исследователи сконструировали биореактор на основе этанола. Наконец, поры, присутствующие в белках оболочки, контролируют проницаемость оболочки: они могут быть мишенью для биоинженерии, поскольку они могут быть изменены, чтобы обеспечить пересечение выбранных субстратов и продуктов.
