Войти
Это изображение является иллюстрацией связывания анти-miRNA с miRNA посредством гибридизации. Это один из двух способов, которыми AMO могут взаимодействовать с miRNA в организме. Путем гибридизации последовательности miRNA функция последовательности miRNA нейтрализуется путем предотвращения ее избирательного связывания с целевой генетической информацией. Хотя эта диаграмма иллюстрирует только генетическое спаривание оснований между последовательностями miRNA и анти-miRNA, существуют определенные химические модификации, которые размещаются на 3 'и 5' концах анти-miRNA. Олигонуклеотиды против miRNA (также известные как AMO) имеют множество применений в клеточной механике. Эти синтетически сконструированные молекулы используются для нейтрализации функции микроРНК (miRNA ) в клетках для получения желаемых ответов. miRNA представляют собой комплементарные последовательности (≈22 п.н.) мРНК, которые участвуют в расщеплении РНК или подавлении трансляции. Контролируя miRNA, которые регулируют мРНК в клетках, AMO можно использовать в качестве дополнительной регуляции, а также для терапевтического лечения определенных клеточных нарушений. Эта регуляция может происходить посредством стерического блокирующего механизма, а также гибридизации с miRNA. Эти взаимодействия внутри организма между miRNA и AMO могут быть использованы для лечения расстройств, при которых происходит чрезмерная / недостаточная экспрессия или аберрации miRNA приводят к проблемам с кодированием. Некоторые из связанных с miRNA нарушений, которые встречаются у людей, включают рак, мышечные заболевания, аутоиммунные нарушения и вирусы. Чтобы определить функциональность определенных AMO, необходимо измерить экспрессию связывания AMO / miRNA (концентрацию транскрипта) в сравнении с экспрессией выделенной miRNA. Прямое обнаружение различных уровней генетической экспрессии позволяет показать взаимосвязь между AMO и miRNA. Это можно обнаружить по активности люциферазы (биолюминесценции в ответ на целевую ферментативную активность). Понимание последовательностей miRNA, вовлеченных в эти заболевания, может позволить нам использовать олигонуклеотиды против miRNA для нарушения путей, которые приводят к недостаточной / избыточной экспрессии белков клеток, которые могут вызывать симптомы этих заболеваний.
При разработке олигонуклеотидов против miRNA необходимо учитывать необходимые модификации для оптимизации аффинности связывания, повышения устойчивости к нуклеазам и доставки in vivo. Было несколько поколений дизайнов с попытками разработать AMO с высокой аффинностью связывания, а также высокой специфичностью. В первом поколении использовались нуклеотиды 2’-O-метил РНК с фосфоротиоатными межнуклеотидными связями, расположенными на обоих концах для предотвращения экзонуклеазной атаки. Недавнее исследование обнаружило соединение N, N-диэтил-4- (4-нитронафталин-1-илазо) фениламин (ZEN), которое улучшает аффинность связывания и блокирует деградацию экзонуклеаз. Этот метод был объединен с конструкцией первого поколения для создания нового поколения ZEN-AMO с повышенной эффективностью.
Можно манипулировать различными компонентами AMO, чтобы повлиять на аффинность связывания и эффективность AMO. 2’-сахар AMO можно модифицировать для замещения фтором и различными метильными группами, почти все с повышением аффинности связывания. Однако некоторые из этих модифицированных 2’-сахаров AMO оказывали негативное влияние на рост клеток. Было также показано, что модификация связи 5'-3 'фосфодиэфирного скелета с фосфоротиоратным (P-S) скелетом влияет на сродство к мишени. Было показано, что использование мутации P-S снижает Tm олигонуклеотида, что приводит к более низкому целевому сродству. Последним требованием для AMO является специфичность несоответствия и ограничения длины. Из-за того, что miRNA в одних и тех же семействах имеют общие «затравочные» (общие) последовательности и отличаются только парой дополнительных нуклеотидов ; одна AMO потенциально может нацеливаться на несколько последовательностей miRNA. Однако исследования показали, что это сложно из-за потери активности из-за несоответствия одиночных нуклеотидов. Несоответствие больше трех свидетельствует о полной потере активности. Изменения длины AMO переносились намного лучше, при этом изменения одного нуклеотида и двух нуклеотидов приводили к незначительной потере активности и трех или более к полной потере активности. Усечение одного нуклеотида с 3'-конца привело к небольшому повышению активности AMO.
На этом рисунке показан метод использования наночастиц золота и грузовой ДНК для введения AMO в клетки путем трансфекции in vitro. На основе рисунка 1. Доставка AMO требует in vitro трансфекции в клетки-мишени. В настоящее время существуют трудности с традиционными методами трансфекции, которые приводят к низкой эффективности доставки. Чтобы повысить эффективность доставки AMO, в статье 2011 года предлагается использовать функционализированные наночастицы золота. Наночастицы золота повышают эффективность доставки за счет конъюгирования с ДНК груза, которая отжигается с AMO с использованием комплементарности. ДНК груза прикреплена к поверхности наночастицы. Поскольку многие варианты ДНК и РНК нестабильны в условиях in vivo, носители, такие как наночастицы, необходимы для защиты от разрушения нуклеазами. Эти наночастицы полезны для облегчения поглощения клеткой и передачи генетической информации ядру. Другой метод доставки in vivo, подтвержденный результатами на мышах, - это внутривенное введение AMO. Было показано, что инъекция АМО в хвостовую вену мышам является эффективной. Чтобы эта система была полезной, AMO были конъюгированы с холестерином для увеличения поглощения клеткой через мембрану и были химически модифицированы 2'-OMe фосфорамидитами для предотвращения деградации AMO.
Чтобы обнаружить присутствие и функциональность AMO, исследователи могут наблюдать относительную активность целевого фермента или белка miRNA. Этот метод был использован в исследовании одиночных AMO, нацеленных на множественные miRNA, при котором отслеживалась относительная активность люциферазы в клетках HEK293. Для определения относительных уровней активности люциферазы был включен контроль без присутствующей miRNA. Присутствие функциональных AMO с ингибирующей miRNA могло бы привести к увеличению активности люциферазы из-за инактивации miRNA, подавляющей активность фермента.
Было обнаружено множество заболеваний человека иметь некоторые изменения в экспрессии или аберрации с участием miRNA. Было обнаружено, что miRNA участвует во многих ключевых путях регуляции, которые предположительно связаны с раком, вирусными генами и метаболическими путями, а также с мышечными расстройствами (в частности, сердечно-сосудистыми). Путем нацеливания на клетки, пораженные неправильной экспрессией miRNA, нормальный баланс экспрессии может быть восстановлен с помощью AMO. За счет сведения к минимуму избыточной экспрессии и увеличения недостаточной экспрессии с помощью AMO некоторые из этих генетических нарушений можно потенциально обойти или, по крайней мере, свести к минимуму их симптомы. Это делается путем гибридизации AMO с последовательностями miRNA, которые участвуют в экспрессии конкретных генов. Проблема заключается в том, чтобы найти способ для AMO успешно выполнять свою функцию в концентрациях, достаточных для успеха, и в то же время достаточно низких, чтобы избежать токсичности вектора и самих AMO.
Все раковые образования представляют собой мутации в геномах, вызывающие аномальный рост клеток. Определение факторов, которые способствуют или регулируют этот чрезмерный рост, потенциально могут привести к профилактическому терапевтическому лечению рака. Например, хронические лимфоцитарные лейкозы иллюстрируют область miRNA (mir-15 и mir-16), отсутствующих в геноме при экспрессии этого рака. В то время как при других формах рака, таких как лимфома Беркитта, экспрессия последовательностей миРНК усиливается. Это приводит к предположению, что многие miRNA имеют регуляторные последовательности, участвующие в развитии рака. Если бы они лучше регулировались, возможно, с помощью AMO, возможно, можно было бы регулировать возникновение и прогрессирование рака.
После исследования 540 образцов опухолей различных типов рака было обнаружено, что 15 miRNA были активированы, а 12 - подавлены. На основании исследования был сделан вывод, что эти последовательности миРНК оказывают влияние на рост клеток и апоптоз в клетке. AMO играют роль этого регуляторного фактора для miRNA, участвующих в развитии рака. При связывании с одним затронутым сайтом miRNA эффект оказывается минимальным. Однако за счет создания последовательностей олигонуклеотидов против miRNA для связывания со всеми этими неявными miRNA, в раковых клетках увеличивалась гибель клеток. Одно исследование с участием антагомиров, различных вариантов олигонуклеотидов против miRNA, было сосредоточено на уменьшении индуцированных опухолей у мышей. После 2 недель лечения рост опухоли был подавлен, а регресс был отмечен в 30% случаев. Это показывает, что AMO можно использовать для успешного подавления рака с помощью miRNA. Это ингибирование вызвано прямым замалчиванием взаимодействием miRNA, которые, в свою очередь, связываются с последовательностями мРНК, которые создают белки в раковых клетках, а также усилением контроля клеточных процессов рака.
В развитии тканей у эмбрионов miRNA может играть роль в повышающей или понижающей регуляции специфического мышечного развития. miRNA-1 играет роль в дифференцировке мышц между клетками-предшественниками сердечных и скелетных мышц. В процессе развития, если уровни клеток-предшественников не регулируются должным образом, это может привести к мышечной гипоплазии. Создавая AMO для этих известных miRNA, участвующих в генерации мышц, можно отслеживать специфические механизмы miRNA на протяжении всего процесса генерации мышц, по существу используя созданные AMO для выключения miRNA. Это останавливает производство миогенина (фактора транскрипции, участвующего в миогенезе ). Затем измеряя изменения миогенина по сравнению со стандартным, неингибированным миогенезом, можно определить функцию миРНК как повышающую или понижающую регуляцию синтеза миогенина. Путем дальнейшего понимания того, как определенные последовательности miRNA контролируют развитие мышц, можно использовать AMO для обеспечения нормального уровня продукции миогенина в организмах, которые, как было обнаружено, содержат генетические ошибки, связанные с миогенезом.
AMO также можно использовать для предотвращения апоптоза или гипоплазии органов сердца в присутствии высоких концентраций перекиси водорода. Перекись водорода может вызывать апоптоз через окислительный стресс. Это связано с тем, что окислительный стресс, вызванный H. 2O. 2, индуцирует повышенную активность miRNA-1. Эта повышенная активность miRNA-1 подавляет активность Bcl-2, вызывая апоптоз. Однако путем создания и введения AMO для miRNA-1 в среде окислительного стресса реакция на H. 2O. 2снижается, создавая в сердце устойчивость к окислительному стрессу. Из-за этого количество индуцированного перекисью водорода апоптоза кардиомиоцитов снижается при сердечных заболеваниях. Благодаря снижению гибели кардиомиоцитов в условиях окислительного стресса олигонуклеотидом против miRNA-1, регуляция miRNA может позволить нам более глубоко понять развитие сердца, а также выживание сердечной мышцы в условиях низкого содержания кислорода.
Эта диаграмма иллюстрирует различные места в процессе специфичности лимфоцитов, которые регулируют miRNA. Каждый из этих сайтов может быть чрезмерно или недоэкспрессирован, что может привести к гипер / гипочувствительности иммунной системы. На основании рисунка 2 Аутоиммунные расстройства возникают, когда организм имеет иммунный ответ на сам себя, вызывая воспалительную реакцию в организме. Поскольку аутоиммунные расстройства связаны с аномалиями в клетках иммунной системы (то есть B-клетках, T-клетках). Можно сделать вывод, что miRNA сильно экспрессируются в областях тела, которые имеют отношение к созреванию этих T- и B-лимфоцитов, например, в селезенке и лимфатических узлах. Нарушения миРНК или функции миРНК в посттранскрипционном процессе могут привести к повышенной чувствительности лимфоцитов. Благодаря повышенной чувствительности эти лимфоциты теперь могут нацеливаться на антигены, которые ранее не могли связываться, что может позволить этим лимфоцитам атаковать сами себя, если эти антигены естественным образом встречаются в клетках организма.
Одним из примеров этого является ревматоидный артрит, при котором тело ломает собственные суставы. Нарушение вызвано сверхэкспрессией специфических кластеров miRNA. Эти скопления вызывают увеличение синовиальных фибробластов. Из-за этого повышенного количества фибробластов повышаются концентрации некоторых протеаз, что вызывает разрушение хряща в суставах. Путем воздействия на кластеры miRNA, ответственные за экспрессию заболевания, воспаление, вызванное этим заболеванием, может быть уменьшено при добавлении AMO в пораженные участки.
Системная красная волчанка вызывает долговременное повреждение органов тела. Размножается за счет экологических и генетических факторов. Путем нацеливания на микроРНК (miR-184, miR-196a, miR-198 и miR-21), которые подавляются при СКВ с помощью AMO в пораженных органах, можно восстановить нормальную экспрессию этих генов.
Считается, что клеточные миРНК подавляют экспрессию вирусных генов. В исследовании ВИЧ-1 были использованы ингибиторы анти-miRNA для деактивации двух miRNA, которые ингибируют экспрессию вирусного гена, has-miR-29a и 29b. Было показано, что экспрессия вирусных генов увеличивалась после введения анти-miRNAs, нацеленных на has-miR-29a и 29b. Это продемонстрировало, что ингибиторы miRNA способны напрямую нацеливать и отменять ингибирующий эффект has-miR-29a и 29b в вирусе ВИЧ-1. Благодаря созданию AMO некоторые геномные последовательности ВИЧ можно было изучить более глубоко. Дальнейшее понимание того, как работает геном определенных вирусов, может позволить ученым разработать превентивные меры против этих вирусов.
Механизм регуляции анти-miRNA в случае вируса Эпштейна-Барра (EBV) немного отличается от других вирусных случаев, таких как ВИЧ-1. EBV - это вирус герпеса, связанный с различными видами рака, который обладает способностью экспрессировать miRNA, в отличие от многих других вирусов, поражающих людей. В отличие от других исследований, которые используют анти-miRNA в качестве инструмента нокдауна для демонстрации эффектов miRNA, исследователи EBV использовали их для ингибирования miRNA, продуцируемых вирусом. MiR-BART5, miRNA EBV, регулирует белок: p 53 U p-регулируемый M одулятор A поптоза (PUMA). Когда вирусный mir-BART5 истощался с помощью его анти-miRNA, анти-miR-BART5, запускался апоптоз клеток, что приводило к контролю заболевания, убивая клетки, которые идентифицированы как инфицированные.
-вирусное взаимодействие, опосредованное микроРНК, происходит с вирусом гепатита С (HCV). ВГС, который вызывает острую инфекцию печени, часто не выявляемую и прогрессирующую в хроническую, использует человеческую miRNA miR-122 для рекрутирования белков Argonaute2 на незащищенный 5'-конец своего РНК-генома, тем самым маскируя его от клеточного противовирусного ответа и стабилизируя Это. Это взаимодействие привело к развитию AMO, которые нацелены на miR-122, чтобы удалить вирус из клеток печени. Наиболее продвинутым из этих соединений является миравирсен, миксмер заблокированной нуклеиновой кислоты -ДНК, который в настоящее время проходит клинические испытания. Интересным аспектом миравирсена является его способность ингибировать не только зрелую miR-122, но также вторгаться в структуры стволовых петель в молекулах-предшественниках микроРНК, нарушая биогенез miR-122 в биохимических анализах и культуре клеток.
