Войти
Две возможности проверены экспериментом Луриа – Дельбрюка. (A) Если мутации индуцируются средой, ожидается, что примерно одинаковое количество мутантов появится на каждой чашке. (B) Если мутации возникают спонтанно во время деления клеток перед посевом, на каждой чашке будет сильно варьирующееся количество мутантов. Эксперимент Лурии-Дельбрюк (1943) (также называемый Колебание тест) показал, что в бактерии, генетические мутации возникают при отсутствии селективного давления вместо того, чтобы в ответ на него. Таким образом, делается вывод, что теория Дарвина о естественном отборе, воздействующем на случайные мутации, применима как к бактериям, так и к более сложным организмам. Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия получили Нобелевскую премию 1969 года по физиологии и медицине частично за эту работу.
К 1940-м годам идеи наследования и мутации стали общепринятыми, хотя роль ДНК как наследственного материала еще не была установлена. Считалось, что бактерии чем-то отличаются друг от друга и могут развить наследственные генетические мутации в зависимости от обстоятельств, в которых они оказались: короче говоря, была ли мутация у бактерий преадаптивной (предсуществующей) или постадаптивной (направленная адаптация)? Лурия, в частности, был одержим этой идеей и был полон решимости проверить ее. Он задумал эксперимент на факультете танца в Университете Индианы, наблюдая за игровым автоматом.
В своем эксперименте Лурия и Дельбрюк инокулировали небольшое количество бактерий ( Escherichia coli ) в отдельные культуральные пробирки. После периода роста они высевали равные объемы этих отдельных культур на агар, содержащий фаг Т1 (вирус). Если устойчивость бактерий к вирусу была вызвана индуцированной активацией бактерий, т.е. если устойчивость не была вызвана наследственными генетическими компонентами, то каждая чашка должна содержать примерно одинаковое количество устойчивых колоний. Предполагая постоянную скорость мутаций, Лурия предположил, что если мутации произошли после и в ответ на воздействие селективного агента, количество выживших будет распределено в соответствии с распределением Пуассона со средним значением, равным дисперсии. Это было не то, что обнаружили Дельбрюк и Лурия: вместо этого количество устойчивых колоний на каждой чашке сильно варьировалось: дисперсия была значительно больше, чем среднее значение.
Лурия и Дельбрюк предположили, что эти результаты можно объяснить возникновением постоянной скорости случайных мутаций в каждом поколении бактерий, растущих в исходных пробирках для культивирования. Основываясь на этих предположениях, Дельбрюк вывел распределение вероятностей (теперь называемое распределением Луриа-Дельбрюка ), которое дает соотношение между моментами, согласующееся с экспериментально полученными значениями. Распределение, которое следует из гипотезы направленной адаптации (распределение Пуассона), предсказало моменты, несовместимые с данными. Таким образом, был сделан вывод, что мутации у бактерий, как и у других организмов, носят скорее случайный, чем направленный характер.
Результаты Лурии и Дельбрюка были подтверждены Ньюкомбом более наглядным, но менее количественным образом. Ньюкомб инкубировал бактерии в чашке Петри в течение нескольких часов, затем реплику поместил на две новые чашки Петри, обработанные фагом. Первую чашку оставили нераспространенной, а затем повторно распределили вторую чашку, то есть бактериальные клетки перемещали, позволяя отдельным клеткам в некоторой колонии образовывать свои собственные новые колонии. Если бы колонии содержали устойчивые бактериальные клетки до того, как вступили в контакт с фаговым вирусом, можно было бы ожидать, что некоторые из этих клеток будут формировать новые устойчивые колонии на чашке для повторной обработки и, таким образом, найти там большее количество выживших бактерий. Когда обе чашки инкубировали для роста, на самом деле количество бактериальных колоний на чашке для повторного считывания было в 50 раз больше. Это показало, что бактериальные мутации в отношении устойчивости к вирусу случайно произошли во время первой инкубации. И снова мутации произошли до применения отбора.
Совсем недавно результаты Лурии и Дельбрюка были подвергнуты сомнению Кэрнсом и другими исследователями, которые изучали мутации метаболизма сахара как форму экологического стресса. Некоторые ученые предполагают, что этот результат мог быть вызван отбором для амплификации гена и / или более высокой скоростью мутаций в клетках, неспособных делиться. Другие защищают исследования и предлагают механизмы, которые объясняют наблюдаемые явления, согласующиеся с адаптивным мутагенезом.
Это распределение, по-видимому, было впервые определено Холдейном. В 1991 году в Университетском колледже Лондона была обнаружена неопубликованная рукопись, описывающая это распространение. Вывод другой, но результаты трудно вычислить без использования компьютера.
Небольшое количество клеток используют для инокуляции параллельных культур в неселективной среде. Культуры выращивают до насыщения, чтобы получить равные плотности клеток. Клетки высевают на селективную среду для определения количества мутантов ( r). Разведения наносят на богатую среду для расчета общего количества жизнеспособных клеток ( N t). Количество мутантов, которые появляются в насыщенной культуре, является мерой как скорости мутаций, так и того, когда мутанты возникают во время роста культуры: мутанты, появляющиеся на ранних этапах роста культуры, будут размножать гораздо больше мутантов, чем те, которые возникают позже во время роста культуры. рост. Эти факторы приводят к тому, что частота ( r / N t) сильно варьируется, даже если количество мутационных событий ( m) одинаково. Частота не является достаточно точным показателем мутации, и всегда следует рассчитывать частоту мутаций ( m / N t).
Оценка скорости мутации (μ) сложна. Лурия и Дельбрюк оценили этот параметр по среднему значению распределения, но впоследствии было показано, что эта оценка смещена.
Метод медианы Ли-Коулсона был введен в 1949 году. Этот метод основан на уравнении
С тех пор этот метод был улучшен, но эти более точные методы сложны. Оценщик максимального правдоподобия Ма-Сандри-Саркара в настоящее время является наиболее известным оценщиком. Описан ряд дополнительных методов и оценок по экспериментальным данным.
В свободном доступе два веб-приложения для расчета частоты мутаций: Falcor и bz -rates. Bz -rates реализует обобщенную версию оценки максимального правдоподобия Ма-Сандри-Саркара, которая может учитывать относительную дифференциальную скорость роста между мутантными и клетками дикого типа, а также оценку производящей функции, которая может оценивать как скорость мутаций, так и дифференциальная скорость роста. Рабочий пример показан в этой статье Jones et al.
Во всех этих моделях предполагалось, что скорость мутаций ( μ) и скорость роста ( β) постоянны. Модель можно легко обобщить, чтобы ослабить эти и другие ограничения. Эти показатели, вероятно, будут отличаться в неэкспериментальных условиях. Модели также требуют, чтобы N t μ gt;gt; 1, где N t - общее количество организмов. Это предположение, вероятно, будет верным в наиболее реалистичных или экспериментальных условиях.
Лурия и Дельбрюк оценили частоту мутаций по уравнению
где β - скорость роста клеток, n 0 - начальное количество бактерий в каждой культуре, t - время, а
где N s - количество культур без устойчивых бактерий, а N - общее количество культур.
Модель Ли и Коулсона отличалась от оригинала тем, что они рассматривали набор независимых процессов Юла (отфильтрованный процесс Пуассона ). Численное сравнение этих двух моделей с реалистичными значениями параметров показало, что они мало различаются. Производящая функция для этой модели была найдена Бартлетт в 1978 году и
где μ - частота мутаций (предполагается, что она постоянная), φ = 1 - e - βt, где β - скорость клеточного роста (также предполагается, что она постоянная), а t - время.
Определение μ из этого уравнения оказалось трудным, но решение было найдено в 2005 году. Дифференциация производящей функции по μ позволяет применить метод Ньютона-Рафсона, который вместе с использованием функции оценки позволяет получить уверенность интервалы для μ.
Механизм устойчивости к фагу T1, по-видимому, был обусловлен мутациями в гене fhu A - мембранном белке, который действует как рецептор T1. Продукт гена тонны B также необходим для заражения T1. Белок FhuA активно участвует в транспорте феррихрома, альбомицина и рифамицина. Он также придает чувствительность к микроцину J25 и колицину M и действует как рецептор для фагов T5 и phi80, а также T1.
Белок FhuA имеет бета-бочкообразный домен (остатки от 161 до 714), который закрыт глобулярным пробковым доменом (остатки от 1 до 160). Внутри пробкового домена находится связывающая область TonB (остатки с 7 по 11). Большая мембрана, охватывающая мономерные β-бочкообразные домены, имеет 22 β-тяжи переменной длины, некоторые из которых выходят значительно за пределы гидрофобного ядра мембраны во внеклеточное пространство. Существует 11 внеклеточных петель, пронумерованных от L1 до L11. Петля L4 - это место, где связывается фаг T1.
![{\ displaystyle \ mu = {\ frac {\ beta \ ln (\ rho)} {n_ {0} [1- \ exp (\ beta t)]}}}](https://wikimedia.org/api/rest_v1/media/math/render/svg/d63c6853332d87b431b4314bc6e62793c4f79d85)
