Войти
Серия биохимических переключателей контролирует переходы между и внутри различных фаз клеточный цикл. Клеточный цикл - это серия сложных, упорядоченных, последовательных событий, которые управляют тем, как одна клетка делится на две клетки, и включает несколько различных фаз. Фазы включают фазы G1 и G2, репликацию ДНК или S-фазу и фактический процесс деления клеток, митоз или M-фазу. Во время фазы M хромосомы разделяются и происходит цитокинез.
Переключатели завершенной упорядоченной фазы перед переходом к следующей фазе, чтобы правильное правильное состояние каждой фазы перед переходом к следующей фазе. Например, Cdk, или циклинзависимая киназа, является главным переключателем контроля клеточного цикла и позволяет клетке переходить от G1 к S или G2 к M путем добавления фосфата к белковым субстратам. Было показано, что такие многокомпонентные (включающие несколько взаимосвязанных белков) переключатели генерируют решающие, надежные (и первые необратимые) переходы и запускают стабильные колебания. В результате они являются предметом активных исследований, которые пытаются понять, как сложные свойства связаны с системой биологического контроля.
Многие биологические цепи производят сложные выходы с использованием одного или нескольких контуров обратной связи. В последовательность биохимических событий обратная связь будет относиться к нижележащему элементу в последовательном (B на соседнем изображении), имеющем некоторый вышестоящий компонент (A на соседнем изображении), чтобы повлиять на его собственное производство или активацию (выход) в будущем. Если этот элемент действует для улучшения своего собственного вывода, то он вызывает положительную обратную связь (синяя стрелка). Петля положительной обратной связи также известна как самоусиливающаяся петля, и вполне возможно, что эти петли могут быть частью более крупной петли, поскольку это характерно для регуляторных схем.
И наоборот, если этот элемент приводит к собственному ингибированию через восходящие элементы это канонически отрицательная обратная связь (тупая красная стрелка). Петля отрицательной обратной связи также известна как балансирующая петля, часто встречаются колебания, в которых используется сигнал отрицательной обратной связи с задержкой для поддержания гомеостатического баланса в системе.
Петли обратной связи Обратная связь (положительный) или самокоррекция (отрицательный). Правильная комбинация контуров положительной и отрицательной обратной связи может генерировать сверхчувствительность и бистабильность, что, в свою очередь, может генерировать решающие переходы и колебания.
Контуры положительной и отрицательной обратной связи не всегда работают четко. В механизме биохимических переключателей они работают вместе, создавая гибкую систему. Например, согласно Pfeuty Kaneko (2009), чтобы преодолеть недостаток биохимических систем, петли регулирования положительной обратной связи могут взаимодействовать с петлями отрицательной регуляции, чтобы облегчить выход из стабильных состояний. Сосуществование двух стабильных состояний известно как бистабильность, которая часто является результатом регулирования положительной обратной связи.
Пример взаимодействия множества контуров отрицательной и положительной обратной связи, активация циклин-зависимых протеинкиназ, или Cdks14. Петли положительной обратной связи играет роль, переключает клетки с низкой низкой активностью. Взаимодействие между двумя типами петель очевидно при митозе. В то время как положительная обратная связь инициирует митоз, петля отрицательной обратной связи способствует инактивации циклин-зависимых киназ комплексом, стимулирующим анафазу. Этот пример показывает комбинированные эффекты, которые петли положительной и отрицательной обратной связи осуществляют на регуляцию клеточного цикла.
Реакция «все или ничего» на стимул называется сверхчувствительностью. Другими словами, очень небольшое изменение вызывает очень большое изменение реакции, создавая сигмоидальную кривую зависимости от дозы. Сверхчувствительный отклик описывается общим уравнением V = S / (S + K m), известным как уравнение Хилла, когда n, коэффициент Хилла, больше 1. Крутизна сигмоидальной кривой зависит от значения n. Значение n = 1 дает гиперболический или михаэловский ответ. Сверхчувствительность достигается в самых разных системах; Ярким примером является совместное связывание фермента гемоглобина с его субстратом. Сверхчувствительный ответ почти «цифровой», его можно использовать для усиления ответа на стимул или для резкого перехода (между состояниями «выключено» и «включено»).
Сверхчувствительность играет роль в регуляции клеточного цикла. Например, Cdk1 и Wee1 являются митотическими регуляторами, и они способны инактивировать друг друга посредством ингибирующего фосфорилирования. Это представляет собой контур отрицательной обратной связи, в котором оба регулятора инактивируют друг друга. По данным Kim et al. (2007), для генерации бистабильного ответа должен быть сверхчувствительный элемент. Оказывается, Wee1 обладает сверхчувствительным ответом на Cdk1, и это, вероятно, возникает из-за конкуренции между различными сайтами фосфорилирования на Wee1.
Бистабильность подразумевает гистерезис, а гистерезис подразумевает мультистабильность. Мультистабильность указывает на наличие двух или более стабильных состояний для данного входа. Следовательно, бистабильность - это способность системы существовать в двух устойчивых состояниях. Другими словами, диапазон значений стимула, для которого ответ может иметь два установившихся значения. Бистабильность сопровождается гистерезисом, что означает, что система приближается к одному из двух устойчивых состояний в зависимости от ее предыстории. Бистабильность требует обратной связи, а также сверхчувствительного элемента схемы.
При определенных обстоятельствах контуры положительной и отрицательной обратной связи могут обеспечить условия для бистабильности; например, за наличие положительной обратной связи, со сверхчувствительным ответным делом со схемой. Гистерезисная бистабильная система может действовать как надежный обратимый переключатель, потому что система труднее переходить между состояниями «включено» и «выключено» (по сравнению с эквивалентным моностабильным сверхчувствительным откликом). Система также может быть уравновешена так, чтобы один из переходов был физически недостижим; например, никакое уменьшение стимула не вернет в состояние «выключено», если она уже находится в состоянии «включено». Это сформировано бы надежный необратимый переключатель.
Не существует взаимно однозначного соответствия между топологией сети. Топология сети не предполагает ввода или вывода, аналогичный ввод или вывод не предполагает топологию сети. По этой параметризация очень важна для работы схемы. Если динамика ввода сопоставима или быстрее отклика системы, отклик может казаться гистерезисным.
Три переключателя клеточного цикла ниже, которые обеспечивают резкие и / или необратимые переходы за счет использования некоторых из механизмов, описанных выше.
Переход G1 / S, более известный как Начальная контрольная точка у почкующихся дрожжей (точка ограничения у других организмов), регулирует обязательство клеточного цикла. В этой точке клетки останавливаются до репликации ДНК (из-за ограничения питательных веществ или сигнала феромона), либо продлевают G1 (контроль размера), либо начинают репликацию и прогрессируют в остальной части клеточного цикла. Регуляторная сеть или регулон G1 / S у почкующихся дрожжей включает циклины G1 Cln1, Cln2 и Cln3, Cdc28 (Cdk1), факторы транскрипции SBF и MBF и ингибитор транскрипции Whi5. Cln3 взаимодействует с Cdk1, чтобы инициировать последовательность событий путем фосфорилирования большого количества мишеней, включая SBF, MBF и Whi5. Фосфорилирование Whi5 заставляет его перемещаться из предотвращения, предотвращая его ингибирование SBF и MBF. Активный SBF / MBF управляет переходом G1 / S, включая циклины B-типа и инициируя репликацию ДНК, образование зачатков и дупликацию тела веретена. Более, SBF / MBF управляет экспрессией Cln1 и Cln2, которые также могут взаимодействовать с Cdk1, способствуя фосфорилированию своих мишеней.
Первоначально предполагалось, что переключатель G1 / S функционирует как линейная последовательность событий, начиная с Cln3 и заканчивая S-фазой. Однако наблюдение, что любое из Cln было достаточно для активации регулона, что Cln1 и Cln2 могли показывать, что задействовать положительную обратную связь для активации транскрипции. Это приведет к непрерывно ускоряющемуся циклу, который может действовать как необратимый бистабильный триггер. Skotheim et al. использовали одноклеточные измерения у почкующихся дрожжей, чтобы показать, что положительная обратная связь действительно имеет место. Небольшое количество Cln3 индуцирует экспрессию Cln1 / 2, и затем вступает в действие петля обратной связи, приводящая к быстрому и резкому выходу Whi5 из ядра и, следовательно, к когерентной экспрессии генов регулона G1 / S. В отсутствие когерентной экспрессии генов клеточного цикла требуется больше времени для выхода из G1, а значительная часть даже останавливается перед S-фазой, что указывает на значительную положительную обратную связь в усилении переключения G1 / S.
контрольная точка клеточного цикла G1 / S контролирует переход эукариотических клеток из первой фазы разрыва, G1, в фазу синтеза ДНК, S. В этом переключении в клетках млекопитающих есть две киназы клеточного цикла, которые обеспечивают контрольную точку: киназы клеточного цикла CDK4 / 6-циклин D и CDK2-циклин E. Транскрипционный комплекс, который включает Rb и E2F, важен для контроля этой контрольной точки. В первой фазе гэпа репрессорного комплекса Rb-HDAC связывается с факторами транскрипции E2F-DP1, тем самым ингибируя транскрипцию ниже по ходу. Фосфорилирование Rb с помощью CDK4 / 6 и CDK2 диссоциирует комплекс Rb-репрессор и служит переключателем включения / выключения для клеточного цикла. После фосфорилирования Rb происходит подавление транскрипционной активности E2F. Это позволяет транскрипцию генов S-фазы, кодирующие белки, которые усиливают переключение G1-фазы на S.
Многие стимулы используют контрольные точки, включая TGFb, повреждение ДНК, контактное торможение, репликативное старение и устранение факторов роста. Первые четыре путем индукции членов семейств INK4 или Kip / Cip ингибиторов киназ клеточного цикла. TGFb ингибирует транскрипцию Cdc25A, фосфатазы, которая активирует киназы клеточного цикла, а отмена фактора активирует GSK3b, который фосфорилирует циклин D. Это приводит к его быстрому убиквитинированию.
G2 начинается с E2F-опосредованной транскрипции циклина A, который образует комплекс циклин A-Cdk2. Чтобы перейти в митоз, комплекс циклин B - Cdk1 (впервые впервые как MPF или фактор, способствующий M-фазе; Cdk1 также известен как Cdc2 у делящихся дрожжей и Cdc28 в почковании. Дрожжи) активируется Cdc25, протеином фосфатазой. Когда митоз начинается, ядерная оболочка распадается, хромосомы конденсируются и становятся видимыми, и клетка готовится к делению. Активация циклина B-Cdk1 приводит к разрушению ядерной оболочки, что является характеристикой инициации митоза.
Комплекс циклин B-Cdk1 участвует в регуляторной цепи, в которой Cdk1 может фосфорилировать и активировать свой активатор, Cdc25 (положительная обратная связь), а также фосфорилируют и инактивируют свой инактиватор, киназу Wee1 ( двойная отрицательная обратная связь). Эта схема может действовать как бистабильный триггер с одним стабильным устойчивым состоянием в G2 (Cdk1 и Cdc25 выключены, Wee1 включен) и вторым стабильным устойчивым состоянием в фазе M (Cdk1 и Cdc25 активны, Wee1 выключены). Однако Wee1 сам регулируется другими факторами, такими как Cdr2.
. Это было предложено и защищено Jin et al. в своей серии экспериментов с клеточной линией человека HeLa в 1998 г. Развернулось, что это пространственное расположение циклина, которое запускает митоз. Известно из предыдущих экспериментов как с человеческими клетками, так и с ооцитами морских звезд, Jin et al. Подводя итог, можно сказать, что циклин B1 в большом количестве присутствует в цитоплазме во время неделящихся фаз митоза, но идентифицируется в ядре в комплексе с Cdk1 непосредственно перед тем, как клетка входит в митоз. Другие экспериментаторы показали, что клетки не будут делиться, если циклин B останется в цитоплазме. Для изучения пространственного расположения циклина B на деление клеток и контроля цикла Jin et al. пометил циклин B сигналом ядерной локализации (NLS), который удерживает циклин в ядре. Первоначально этот NLS циклин B не вызывал ожидаемого эффекта ускоренного митотического входа. Этот результат связан с ингибированием, показанным на рисунке ниже. Wee1, ингибитор комплекса циклин B-Cdk1, локализуется в ядре и, вероятно, фосфорилирует NLS-циклин B, делает его неспособным функционировать так, как предполагалось. Это предположение подтвердилось, когда Jin et al. использовали Cdc2AF, нефосфорилирующий мутант Cdk1, и наблюдали ускоренное начало клеточного деления из-за ядерной локализации циклина B. Следовательно, ядерная локализация циклина B необходима, но недостаточна для запуска деления клеток.
При исследовании регуляции клеточного цикла Jin et al. манипулировали клетками, чтобы оценить локализацию циклина B в клетках с повреждением ДНК. Посредством локализации повреждений ДНК и ядерной ДНК обнаружены клетки ДНК экзогенного циклина. Это предполагает, что пространственная локализация циклина B может играть роль контрольной точки митоза. Если клетки в клеточных условиях не делятся, то их генетическая информация повреждена, но вступают в митоз, если в ядре экспрессируется эндогенный циклин B, вполне вероятно, что перемещение циклина B в цитоплазму является механизмом, который предотвращает незрелое митотическое проникновение. Эта гипотеза была дополнительно подтверждена анализом Jin et al. Клеток, задержанных в G2 из-за повреждений ДНК. В этих клетках Jin et al. наблюдали высокие уровни активности циклин B-Cdc2 в цитоплазме. Это подтверждает доказательство ранее упомянутой теории, что оно показывает, что Cdc2 может активировать циклин без немедленной транслокации в ядро. Кроме того, накопление комплексов циклин B-Cdk1 в клетках цитоплазме, которые не деляются из-за повреждений ДНК, подтверждает теорию о том, что именно ядерная локализация циклина B инициирует митотический вход.
Итак, пространственная локализация циклина B играет роль в митотическом входе. Транслокация циклина B из цитоплазмы необходима для деления клетки, но недостаточна, поскольку его ингибиторы не позволяют клетке преждевременно вступить в митоз. В дополнение к резервному ингибированию комплекса циклина B-Cdk1, преждевременное деление клеток предотвращает транслокацию самого циклина B. Комплекс циклин B-Cdk1 будет оставаться в цитоплазме в клетках с повреждением ДНК, не перемещаясь в ядро, удерживая клетку от входа в митоз. Следующий вопрос, который задают исследователи в этой области, заключается в том, каким конкретным механизмом регулируется эта транслокация.
Сантос и др. предположили, что транслокация циклина B регулируется механизмом положительной обратной связи, подобным тому, который регулирует активацию комплекса циклина B-Cdk1. Они, что петля положительной обратной связи включают фосфорилирование циклина B и его транслокацию в ядро. Чтобы начать это исследование, они сначала подтвердили некоторые результаты, Jin et al. эксперименты, использующие иммунофлуоресценцию, чтобы показать циклин B в цитоплазме до деления, и транслокацию в ядро, чтобы инициировать митоз, которые они использовали, сравнивая их с разрушением ядерной оболочки (NEB). Используя ядерный циклин, который не может быть инактивирован Wee1 или Myt1, Santos et al. наблюдали, что активный ядерный циклин рекрутирует больше циклина из цитоплазмы, чтобы быть перемещенным в ядро. Они подтвердили это наблюдение, применив лечение рапамицином, iRap. iRap индуцирует транслокацию меченого циклина B из цитоплазмы в ядро. Примечательно, что Santos et al. видели, что немеченый циклин B мигрировал вместе с циклином B под влиянием iRap. Непомеченный циклин не зависит от лечения и перемещается независимо от обработанного циклина. Это поддерживает первую часть петли положительной обратной связи, то есть ядерная локализация циклина B, которая приводит к митотическому входу, способствует усиленной транслокации цитоплазматического циклина B в ядро, дополнительно способствуя миграции оставшегося цитоплазматического циклина B в ядро и т. Д.
Сантос и др. далее выдвигают гипотезу, что фосфорилирование циклина B является другим компонентом петли положительной обратной связи. Они заметили, что циклин B естественным образом проникает в ядро до NEB. Напротив, мутировавший нефосфорилируемый циклин B проникает в ядро во время NEB. Это неожиданно, потому что для клеточного цикла характерно перемещение циклина в ядро до NEB, чтобы индуцировать прогрессию клеточного цикла в митотическое деление. Таким образом, Santos et al. пришли к выводу, что фосфорилирование циклина B способствует транслокации в ядро. Однако, кроме того, перемещение в ядро способствует фосфорилированию циклина. Авторы отмечают, что фосфорилирование циклина B в ядре в девятнадцать раз более благоприятно, чем в цитоплазме, из-за меньшего общего объема ядра, что обеспечивает более высокую скорость фосфорилирования. Повышенная транслокация из-за фосфорилирования и повышенное фосфорилирование из-за транслокации иллюстрируют петлю положительной обратной связи, которая напоминает ранее обнаруженную, которая активирует комплекс циклин B-Cdk1.
В заключение, ядерная локализация циклина B необходима для клеточного вступления в митоз. Транслокация циклина из цитоплазмы в ядро, которая делает возможным клеточное деление, регулируется петлей положительной обратной связи. Активный циклин B перемещается в ядро и способствует активации и перемещению дополнительных единиц циклина, находящихся в ядре. Это явление усиливается при рассмотрении фосфорилирования. Фосфорилирование циклина B способствует транслокации в ядро, а циклин B в ядре с гораздо большей вероятностью будет фосфорилироваться, поэтому ядерная локализация способствует фосфорилированию циклина B в ответ.
Когда клетки находятся в митозе, циклин B-Cdk1 активирует комплекс, способствующий анафазе (APC), который, в свою очередь, инактивирует циклин B-Cdk1, разрушая циклин B, что в конечном итоге приводит к выходу из митоз. Сочетание бистабильной функции ответа Cdk1 с отрицательной обратной связью от APC может генерировать так называемый осциллятор релаксации, с резкими всплесками активности Cdk1, запускающими устойчивые митотические циклы. Однако в релаксационном осцилляторе управляющий параметр движется медленно относительно динамики реакции системы, котораяможет быть точным представлением митотического входа, но не обязательно митотического выхода.
Необходимо инактивировать комплекс циклин B-Cdk1, чтобы выйти из митотической стадии клеточного цикла. Затем используются ячейки, чтобы вернуться к первой фазе перерыва G1 и ждать, пока цикл продолжится снова.
В 2003 г. Pomerening et al. предоставили доказательные доказательства этой гипотезы, предоставили гистерезис и бистабильность активации Cdk1 в цитоплазматических экстрактах ооцитов Xenopus. Они впервые прерывистый резкий ответ Cdk1 на изменение концентраций неразрушаемого Cyclin B (чтобы отделить сеть ответов Cdk1 от APC-опосредованной отрицательной обратной связи). Однако такой ответ будет совместим как с моностабильным сверхчувствительным переходом, так и с бистабильным переходом. Чтобы различать эти две возможности, они измерили устойчивые уровни активного Cdk1 в ответ на изменение уровней циклина, но в двух отдельных экспериментах, один начинался с экстракта интерфазы, а второй - с экстракта, уже находящегося в митозе. При промежуточных концентрациях циклина они используются устойчивые активные Cdk1. Какое из двух устойчивых состояний было занято, зависело от истории системы, т.е. начинались ли они с интерфазы или митотического экстракта, эффективно демонстрируя гистерезис и бистабильность.
В том же году Sha et al. независимо пришли к такому же выводу, обнаружив петлю гистерезиса, также используя экстракты яиц Xenopus laevis. В этой статье были проверены три предсказания модели Новака-Тайсона с целью сделать вывод, что гистерезис является движущей силой его «переходов клеточного цикла в митоз и из». Предсказания модели Новака-Тайсона являются общими для всех бифуркаций седло-узел. Бифуркации седло-узел - необычные бифуркации в несовершенном мире, потому что они описывают несовершенные биологические системы. Первое предсказание заключено в том, что пороговая конструкция циклина для входа в митоз выше, чем пороговая циклина для выхода из митоза, и это было подтверждено добавлением циклических экстрактов яиц неразъемым циклином B и измерением порога активации и инактивации после добавления цикексимида (CHX), который является ингибитором синтеза белка. Кроме того, второе предсказание модели Новака-Тайсона также было подтверждено: нереплицированная дезоксирибонуклеиновая кислота или ДНК увеличивает пороговую концентрациюлина, которая требуется для входа в митоз. Чтобы прийти к такому выводу, были добавлены экстракты, высвобожденные цитостатическим фактором, были дополнены CHX, APH (ингибитор ДНК-полимеразы) или обоими, и был добавлен неразлагаемый циклин B. Третье и последнее предсказание, которое было проверено и подтверждено в этой статье, заключено в том., что скорость активации Cdc2 замедляется вблизи пороговой концентрации циклина. Эти прогнозы и демонстрации демонстрируют переключающееся поведение, которое может быть показано через гистерезисом в динамической системе.
При переходе от метафазы к анафазе, очень важно, чтобы сестринские хроматиды правильно и разделялись на противоположные концы клетки. Разделение сестринских хроматид изначально сильно ингибируется, чтобы предотвратить преждевременное разделение в позднем митозе, но это ингибирование снимается за счет разрушения ингибиторных элементов комплексом, стимулирующим анафазу (APC), после биориентации сестринских хроматид. Достигнут. Одним из этих ингибирующих элементов является секурин, который предотвращает разрушение когезина, комплекс, который удерживает сестринские хроматиды вместе, путем связывания протеазы сепаразы, нацеленной на, субъединица когезинового комплекса, для разрушения. В этой системе фосфатаза Cdc14 может подавлять ингибирующий фосфат из секурина, тем самым облегчая разрушение секурина APC, высвобождая сепаразу. Как показано Uhlmann et al., Во время прикрепления хромосом к митотическому веретену хроматиды остаются парными, потому что сплоченность между сестрами предотвращает разделение. Сплоченность устанавливается во время репликации ДНК и зависит от когезина, который представляет собой комплекс из нескольких субъединиц, состоящий из Scc1, Scc3, Smc2 и Smc3. Ужей при дрожании переходе из метафазы в анафазу Scc1 диссоциирует от хромосом, и сестринские хроматиды отделяются. Это действует контролируется белком Esp1, который прочно связан с ингибитором анафазы Pds1, который разрушается комплексом, стимулирующим анафазу. Чтобы подтвердить, что Esp1 действительно играет роль в регуляции ассоциации хромосомы Scc1, клеточные штаммы были арестованы в G1 с помощью альфа-фактора. Эти клетки оставались заблокированными во время развития. Были использованы мутантные клетки Esp1-1, и эксперимент был повторен, и Scc1 успешно связывался с хромосомами и оставался даже после прекращения синтеза. Это было критически важно для демонстрации того, что с Esp1 способность Scc1 становиться стабильно используемыми с хромосомами во время G1 ограничена, а Esp1 фактически может напрямую удалить Scc1 из хромосом.
Было показано Holt et al. это сепараза активирует Cdc14, который, в свою очередь, действует на секурин, тем самым увеличивая резкость перехода от метафазы к анафазе и координацию сестринских хроматид. Holt et al. исследовали основы эффекта обратной связи при фосфорилировании секурина с помощью мутантных «секурин» штаммов дрожжей и тестировали, как изменения в фосфорегуляции секурина участвовали в синхронности разделения сестринских хроматид. Их результаты показывают, что вмешательство в эту положительную петлю securin-separase-cdc14 снижает синхронность разделения сестринских хроматид. Эта положительная обратная связь может гипотетически генерировать бистабильность при переходе в анафазу, заставляя клетку принимать необратимое решение разделить сестринские хроматиды.
Выход из митоза является точкой точки перехода, которая означает конец митоза и начало новой фазы G1 для клеток, и клетке Когда не пройдет фаза G1, S и G2, пока не пройдет фаза G1, S и G2, и не пройдут все контрольные точки. Многие факторы, включая циклины, циклин-зависимые киназы (CDK), убиквитинлигазы, ингибиторы циклин-зависимых киназ и обратимые фосфорилирование регулируют выход из митоза, устойчивым, что события клеточного цикла происходит в правильном порядке с наименьшим количеством ошибок. Конец митоза характеризуется разрушением веретена, укороченными кинетохорными микротрубочками и выраженным разрастанием астральных (не кинетохорных) микротрубочек. Для нормальной эукариотической клетки выход из митоза необратим.
Рис. 1 Паттерны иммунофлуоресценции циклина B и фосфорилированной циклин-зависимой киназы 1 (Cdk1) в клетках HeLa изменяются по мере перехода от G2 к анафазе. Было высказано предположение предположений относительно механизмов контроля, использования клеточной стимуляции для стимулирования необратимости митотического выхода в модельном эукариотическом организме - почкующихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Протеолитическая деградация регуляторов клеточного цикла и соответствующие эффекты на уровнях циклин-зависимых киназ были предложены в качестве механизма, способствующего эукариотическому клеточному циклу, в частности, переходу от метафазы к анафазе. Согласно этой теории, комплекс, способствующий анафазе, (APC), класс убиквитинлигазы, облегчает деградацию митотических циклинов (Clb2) и факторов, ингибирующих анафазу (PDS1, CUT2), способный к выходу из митоза. APC убиквитинирует мотив из девяти аминокислот, известный как деструктивный бокс (D-бокс) в NH2-концевом домене митотических циклинов для деградации протеасомой. APC в сочетании с Cdc20 (APC-Cdc20) убиквитинат и нацелены на митотические циклины (Clb2) для деградации в начальной фазе. Одновременно APC-Cdc20 опосредует деградацию секуринов, которые ингибируют разделение посредством связывания в начале анафазы. Освобожденная и активная сепараза расщепляет когезин, который удерживает сестринские хроматиды вместе, облегчает разделение сестринских хроматид и инициирует выход из митоза, способствуя высвобождению Cdc14 из ядрышка. Более поздней фазе подавление Cdk1 и активация Cdc14, Cdh1-активирующая фосфатазы, образование APC в ассоциации с Cdh1 (APC-Cdh1) для разрушения Clb2s. Cdc20 и Cdh1, которые являются активаторами APC, привлекают субстраты, такие как секурин и циклины B-типа (Clb), для убиквитинирования. Без комплексов Cdk1-Clb2 для фосфорилирования белков, которые участвуют в динамике веретена, таких как Sli15, Ase1 и Ask1, ускоряется удлинение веретена и хромосомная сегрегация, облегчая выход из митоза. Важность протеолитической деградации в эукариотическом клеточном цикле изменила представление о делении клеток как простом каскаде киназ на более сложный процесс, в котором необходимы взаимодействия между фосфорилированием, убиквитинированием и протеолизом. Однако эксперименты с использованием почкующихся дрожжевых клеток с cdc28-as1, INM-PP1 (аналог АТФ) -чувствительным аллелем Cdk, доказано, что разрушение циклинов B-типа (Clb) не является необходимым для запуска необратимого выхода из митоза. Деградация Clb2 действительно сокращает период ингибирования Cdk1, необходимый для запуска необратимого выхода из митоза, что протеолиз циклина вносит вклад в динамический характер эукариотического клеточного цикла из-за более медленной шкалы времени его действия, но вряд ли будет основным определяющим фактором в запуске необратимого клеточного цикла.
Были сделаны открытия, которые важны уровня ингибиторов циклин-зависимых киназ в регуляции цикла эукариотических клеток. В частности, было показано, что уровень Sic1, стехиометрического ингибитора комплексов Clb-CDK у почкующихся дрожжей, особенно важен для необратимого перехода G1-S посредством необратимой активации киназ S-фазы. Было показано, что уровень Sic1 играет важную роль в запуске необратимого митотического выхода (M-G1), а также в переходе G1-S. Во время митоза снижение уровня Cdk1 вызывает активацию Cdc14, фосфатазы, которая противодействует Cdk1 посредством активации Cdh1 и Swi5, активированного транскрипции белков Sic1. В то время как деградация Sic1 до определенного низкого уровня запускает начало фазы, накопление Sic1 до определенного высокого уровня необходимо для запуска необратимого митотического выхода. Ингибиторы Cdk1 могут индуцировать выход из митоза, даже если деградация циклинов B-типа блокируется экспрессией неразлагаемых Clbs или ингибиторов протеасом. Сестринские хроматиды не могут сегрегировать, и клетки возвращаются к митозу после смывания ингибиторов, достигнуть достижения порогового уровня ингибиторов для запуска необратимого выхода из митоза независимо от деградации циклинов. Несмотря на разные пороги уровня Sic1, которые необходимы для запуска митоза по сравнению с переходом G1-S, было показано, что уровень Sic1 играет ключевую роль в регуляции цикла эукариотических клеток путем ингибирования активности CDK.
Рис. 2 Необратимое и бистабильное переключение при выходе из митоза с контрольным параметром, являющимся уровнем Sic1, и параметром порядка, являющимся фазами клеточного цикла. Поскольку цикл эукариотических клеток включает в себя множество белков и регуляторных взаимодействий, можно применить динамический системный подход для упрощения сложную биологическую схему в общую основу для лучшего анализа. Среди четырех возможных отношений входа / выхода взаимосвязь между уровнем Sic1 и выходом из митоза, по-видимому, демонстрирует характеристики необратимого бистабильного переключения, управляемого обратной связью между APC-Cdh1, Sic1 и Clb2-Cdk1. Бистабильность известно, что он контролирует биологические функции, такие как контроль клеточного цикла и клеточную дифференциацию, и играет ключевую роль во многих клеточных регуляторных сетях. Бистабильные отношения ввода / вывода характеризуются двумя стабильными состояниями с двумя точками бифуркации. Для одного конкретного входа возможны множественные выходы в области бистабильности, отмеченной двумя точками бифуркации. Кроме того, бистабильное соотношение отображает гистерезис: конечное состояние / выход зависит от истории ввода, а также от текущего значения ввода, потому что система имеет память. Одна точка бифуркации имеет отрицательное значение управляющего параметра (точка бифуркации находится по другую сторону оси), что приводит к разрыву между двумя устойчивыми состояниями и необратимости перехода из одного состояния в другое. Что касается выхода из митоза, два стабильных состояния определяются митозом и фазой G1. Как только уровень Sic1 (вход) накапливается сверх порога, происходит необратимый переход от митоза (стабильное состояние I) к фазе G1 (стабильное состояние II). В несовершенной среде единственная бифуркация, которая остается нетронутой, - это бифуркация седло-узел. Бифуркация седло-узел не разрушается (седло-узел - это ожидаемое типичное поведение), тогда как транскритические бифуркации и бифуркации вил разрушаются при наличии дефектов. Таким образом, единственная одномерная бифуркация, которая может существовать в несовершенном биологическом мире, - это бифуркация седло-узел. Бистабильную связь между переходом M-G1 и уровнем Sic1 можно представить в виде диаграммы двух бифуркаций седло-узел, в которых поведение системы качественно меняется при небольшом изменении управляющего параметра, количества Sic1.
Рис. 3 Упрощенная сеть, включающая Cdk1-Clb2, APC-Cdh1, Sic1 и Cdc14. Двойная петля отрицательной обратной связи, опосредованная APC-Cdh1 и Sic1, необходима для подавления Cdk1-Clb2 и запуска митотического выхода. Поскольку поведение клеточного цикла критически зависит от количества Sic1 в переходном состоянии M-G1, количество Sic1 жестко регулируется обратными связями на системном уровне. Поскольку Cdk1-Clb2 ингибирует Sic1, фосфорилируя Sic1 и делая Sic1 доступным для деградации посредством убиквитилирования, APC-Cdh1-зависимая деградация Cdk1-Clb2 не только снижает уровень доступных комплексов Cdk1-Clb2, но также увеличивает уровень Sic1, который, в свою очередь, далее ингибирует функцию Cdk1-Clb2. Эта активация двойной отрицательной петли обратной связи запускается APC-Cdc20-зависимой деградацией Cdk1-Clb2 и высвобождением Cdc14 из ядрышкового белка Net1 / Cfi1. Путь FEAR (раннее высвобождение Cdc14 в анафазу) способствует Clb2-Cdk1-зависимому фосфорилированию Net1, которое временно высвобождает Cdc14 из Net1. Освободившиеся комплексы Cdc14 и Clb2-Cdk1 переходят в веретено, активирует сеть выход из митоза (MEN). MEN обеспечивает замедленное высвобождение Cdc14 из ядрышка, противодействует активности Clb2-Cdk1, активирует Cdh1 и стабилизирует Sic1 посредством активации Sic1-активатора транскрипции Swi5. Sic1 позитивно регулирует себя, подавляя Cdk1-Clb2 для высвобождения ингибирования Swi5, а Cdh1 также положительно регулирует себя, ингибируя Clb2-Cdk1 для высвобождения ингибирования MEN, который может активировать Cdc14 и оказывать сам Cdh1. Петля двойной отрицательной обратной связи, образованная APC-Cdh1 и Sic1, необходимая для поддержания низкой активности Clb2-Cdk1, что Clb2 активирует свой синтез путем активации транскрипционных факторов, комплекс Fkdiv class="ht"– Mcm1 Ndd1.
Цикл эукариотической клетки состоит из различных контрольных точек и петель обратной связи для точного и успешного деления клеток. Например, во время митоза, когда дублированные хромосомы неправильно прикреплены к митотическому веретену, белки контрольной точки сборки веретена (SAC), включая Mad и Bub, ингибируют APC-Cdc20, чтобы задерживать вход в анафазу и деградацию циклинов B- типа. Кроме того, когда митотические веретены смещены, MEN и способны ингибировать Cdc14 Bub2 и Bfa1-зависимым образом для предотвращения деградации митотических циклинов и входа в анафазу. Sic1 - хороший пример, демонстрирующий, как обратные связи системного уровня взаимодействуют, чтобы определять условия окружающей среды и запускать переходы клеточного цикла. Несмотря на то, что фактический переход M-G1 сложный с участием множества компонентов и регуляторов, динамический системный подход позволяет упростить эту сложную систему до бистабильных отношений ввода / вывода с двумя бифуркациями седло-узел, в котором выход (митотический выход) зависит от критического использования из Sic1. Используя одномерный анализ, можно было бы объяснить многие из необратимых переходных точек в эукариотическом клеточном цикле, которые регулируются системным контролем и обратной связью. Другие примеры необратимых точек перехода включают Start (необратимую приверженность к новому бистабильному переключению), что можно объяснить необратимым бистабильным переключением, параметрами управления жестко регулируемыми системными обратными связями, включающими Cln2, Whi5 и SBF.
