Войти
Асимметрия в синтезе ведущих и отстающих цепей Фрагменты Окадзаки представляют собой короткие последовательности ДНК нуклеотиды (приблизительно от 150 до 200 пар оснований длиной в эукариот ), которые синтезируются прерывисто и позже связываются вместе ферментом ДНК-лигаза для создания отстающей цепи во время репликации ДНК. Они были открыты в 1960-х годах японскими молекулярными биологами Рейджи и Цунеко Окадзаки вместе с помощью некоторых из их коллег.
Во время репликации ДНК двойная спираль раскручивается, а дополнительные цепи разделяются ферментом ДНК-геликазой, создавая так называемую репликацию ДНК . вилка. Следуя этой вилке, ДНК-примаза, а затем ДНК-полимераза начинают действовать, чтобы создать новую комплементарную цепь. Поскольку эти ферменты могут работать только в направлении от 5 ’к 3’, две развернутые цепи-матрицы реплицируются по-разному. Одна цепь, ведущая цепь , подвергается непрерывному процессу репликации, поскольку ее матричная цепь имеет направленность от 3 ’к 5’, что позволяет полимеразе, собирающей ведущую цепь, следовать за вилкой репликации без прерывания. Однако отстающая нить не может быть создана непрерывно, потому что ее матричная нить имеет направленность от 5 ’к 3’, что означает, что полимераза должна работать в обратном направлении от вилки репликации. Это вызывает периодические перерывы в процессе создания отстающей пряди. Примаза и полимераза движутся в направлении, противоположном направлению вилки, поэтому ферменты должны постоянно останавливаться и запускаться снова, пока ДНК-геликаза разрывает цепи. Как только фрагменты сделаны, ДНК-лигаза соединяет их в единую непрерывную цепь. Весь процесс репликации считается «полунепрерывным», так как одна из новых цепей формируется непрерывно, а другая - нет.
В 1960-х годах Рейджи и Цунеко Окадзаки провели эксперименты по репликации ДНК в бактерии Escherichia coli. До этого времени обычно считалось, что репликация является непрерывным процессом для обеих цепей, но открытия с участием E. coli привели к новой модели репликации. Ученые обнаружили прерывистый процесс репликации посредством импульсной маркировки ДНК и наблюдения изменений, указывающих на несмежную репликацию.
Синтез фрагментов Окадзаки В работах Кивако Сакабэ Рейджи Окадзаки и Цунеко Окадзаки предоставлены экспериментальные доказательства, подтверждающие гипотезу о том, что репликация ДНК является прерывистым процессом. Раньше считалось, что репликация непрерывна как в направлениях от 3 'до 5', так и от 5 'до 3'. 3 'и 5' представляют собой специально пронумерованные атомы углерода на дезоксирибозном кольце в нуклеиновых кислотах и относятся к ориентации или направленности цепи. В 1967 году Цунеко Окадзаки и Тору Огава предположили, что не существует обнаруженного механизма, который показал бы непрерывную репликацию в направлении от 3 'до 5', только от 5 'до 3' с использованием ДНК-полимеразы, фермент репликации. Команда выдвинула гипотезу, что при использовании прерывистой репликации короткие цепи ДНК, синтезированные в точке репликации, могут быть прикреплены в направлении 5 'к 3' к более старой цепи.
К Экспериментально различая метод репликации, используемый ДНК, команда пометила вновь реплицированные области хромосом Escherichia coli, денатурировала и экстрагировала ДНК. Большое количество радиоактивных коротких единиц означало, что метод репликации, вероятно, был прерывистым. Гипотеза была дополнительно подтверждена открытием полинуклеотида лигазы, фермента, который связывает короткие цепи ДНК вместе.
В 1968 году Рейджи и Цунеко Окадзаки собрали дополнительные доказательства зарождающихся цепей ДНК. Они предположили, что если прерывистая репликация с участием коротких цепочек ДНК, связанных вместе полинуклеотид-лигазой, является механизмом, используемым в синтезе ДНК, то «вновь синтезированные короткие цепочки ДНК будут накапливаться в клетке в условиях, когда функция лигазы временно нарушается». E. coli инфицировали бактериофагом Т4, который продуцирует чувствительную к температуре полинуклеотидлигазу. Клетки, инфицированные фагами Т4, накапливали большое количество коротких, вновь синтезированных цепочек ДНК, как и предполагалось в гипотезе, при воздействии высоких температур. Этот эксперимент также подтвердил гипотезу Оказакиса о прерывистой репликации и связывании полинуклеотидлигазой. Это опровергло представление о том, что короткие цепи также образуются в процессе экстракции.
Эксперименты Окадзакиса предоставили обширную информацию о процессе репликации ДНК и существовании коротких, вновь синтезированных цепочек ДНК, которые позже стали известны как Фрагменты Окадзаки.
.
Для обработки фрагментов Окадзаки было предложено два пути: короткий путь лоскута и длинный путь лоскута.
В пути короткого лоскута у эукариот отстающая цепь ДНК примируется через короткие интервалы. Только в коротком пути участвует нуклеаза FEN1. Pol δ часто встречается с примированным ниже по ходу потоком фрагментом Окадзаки и смещает праймер инициатора РНК / ДНК в 5'-створку. Эндонуклеаза FEN1 5’-3 ’распознает, что 5’-лоскут смещен, и он расщепляется, создавая субстрат для лигирования. В этом методе праймер, синтезированный Pol a, удаляется. Исследования показывают, что в FEN1 предлагается «трекинг; модель, в которой нуклеаза перемещается от 5 ’лоскута к его основанию, чтобы преобразить расщепление. Pol δ не обрабатывает нуклеазную активность, чтобы расщепить смещенный лоскут. FEN1 рассекает короткие лоскуты сразу после их образования. Расщепление ингибируется, когда 5’-конец лоскута ДНК блокируется либо комплементарным праймером, либо биотин-конъюгированным стрептавидиновым фрагментом. ДНК-лигаза запечатывает разрыв, сделанный FEN1, и создает функциональную непрерывную двойную цепь ДНК. PCNA моделирует ферментативные функции белков как для FEN1, так и для ДНК-лигазы. Взаимодействие имеет решающее значение для создания надлежащего лигирования отстающей цепи ДНК. Последовательное смещение цепи и расщепление Pol δ и FEN1, соответственно, помогает удалить всю инициаторную РНК перед лигированием. Чтобы удалить инициаторный праймер, должны произойти многие смещения и реакции расщепления. Лоскут, который создается, обрабатывается и созревает благодаря короткому пути лоскута.
В некоторых случаях FEN1 существует только в течение короткого периода времени и отключается от комплекса репликации. Это вызывает задержку расщепления, при которой створки, смещенные на Pol δ, становятся длинными. Когда RPA достигает достаточно большой длины, он может стабильно связываться. Когда связанные лоскуты RPA реорганизуются для расщепления FEN1, что требует для процессинга другой нуклеазы, это было идентифицировано как альтернативная нуклеаза, ДНК2. ДНК2 имеет дефекты сверхэкспрессии DEN1. DNA2 показал свою работу с FEN1 для обработки длинных лоскутов. ДНК2 может отделять RPA от длинного лоскута, она делает это с помощью механизма, подобного FEN1. Он связывает клапан и заправляет 5 'конец клапана. Нуклеаза расщепляет лоскут, делая его слишком коротким для связывания с RPA, слишком короткий лоскут означает, что он доступен для FEN1 и лигирования. Это известно как метод длинных лоскутов. ДНК2 может действовать как FEN1 в качестве резервной копии нуклеазной активности, но это неэффективный процесс.
До недавнего времени было только два известных пути обработки фрагментов Окадзаки. Однако текущие исследования пришли к выводу, что существует новый путь фрагментации Окадзаки и репликации ДНК. Этот альтернативный путь включает ферменты Pol δ с Pif1, которые выполняют тот же процесс удаления лоскута, что и Pol δ и FEN1.
Примаза добавляет РНК праймеры на отстающей цепи, что позволяет синтезировать фрагменты Окадзаки от 5 'до 3'. Однако примаза создает праймеры РНК с гораздо меньшей скоростью, чем та, с которой ДНК-полимераза синтезирует ДНК на ведущей цепи. ДНК-полимераза на отстающей цепи также должна быть постоянно переработана для построения фрагментов Окадзаки, следующих за праймерами РНК. Это делает скорость синтеза отстающей цепи намного ниже, чем у ведущей цепи. Чтобы решить эту проблему, праймаза действует как временный стоп-сигнал, на короткое время останавливая прогрессию репликационной вилки во время репликации ДНК. Этот молекулярный процесс предотвращает обгон ведущей цепи отстающей.
Новая ДНК образуется во время этой фазы ферментами, которые синтезируют ДНК в направлении от 5 ’к 3’. ДНК-полимераза необходима как для ведущей цепи, которая представляет собой непрерывную цепь, так и для отстающей цепи, которая состоит из небольших кусочков при синтезе ДНК. Этот процесс происходит для удлинения вновь синтезированного фрагмента и вытеснения РНК и сегмента ДНК. Синтез происходит в 3 фазы с двумя разными полимеразами, ДНК-полимеразой α-примазой и ДНК-полимеразой δ. Этот процесс начинается с вытеснения полимеразы α-примазы из праймера РНК и ДНК под действием эффекта репликации загрузчика зажима, этот эффект приводит к сдвигу зажима на ДНК. После этого ДНК-полимераза δ начинает переходить в свою холоферментную форму, которая затем начинает синтез. Процесс синтеза будет продолжаться до тех пор, пока не будет получен 5-й конец предыдущего фрагмента Окадзаки. По прибытии обработка фрагмента Окадзаки переходит к присоединению вновь синтезированного фрагмента к отстающей цепи. Последняя функция ДНК-полимеразы δ состоит в том, чтобы служить дополнением к активности эндонуклеазы 5 ’лоскута FEN1 / RAD27. Аллель rad27-p является летальным в большинстве комбинаций, но был жизнеспособен с полимеразой rad27-p и exo1. Как полимераза rad27-p, так и exo1 демонстрируют сильное синергетическое увеличение мутаций дупликации CAN 1. Единственная причина, по которой эта мутация является жизнеспособной, связана с генами репарации двухцепочечных разрывов RAD50, RAD51 и RAD52. RAD27 / FEN1 создает зазоры между соседними фрагментами Окадзаки, сводя к минимуму степень выталкивания нити в отстающей нити.
Во время синтеза отстающей цепи ДНК-лигаза I соединяет фрагменты Окадзаки после замены праймеров РНК на нуклеотиды ДНК на ДНК-полимераза δ. Фрагменты Окадзаки, которые не были лигированы, могут вызывать двухцепочечные разрывы, которые расщепляют ДНК. Поскольку допускается только небольшое количество двухцепочечных разрывов и только небольшое количество может быть восстановлено, достаточное количество неудач лигирования может быть летальным для клетки.
Дальнейшие исследования указывают на дополнительную роль ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) по отношению к функции ДНК-лигазы I по соединению фрагментов Окадзаки. Когда сайт связывания PCNA на ДНК-лигазе I неактивен, способность ДНК-лигазы I связывать фрагменты Окадзаки серьезно нарушается. Таким образом, предлагается следующий механизм: после того, как комплекс PCNA-ДНК-полимераза δ синтезирует фрагменты Окадзаки, высвобождается ДНК-полимераза δ. Затем ДНК-лигаза I связывается с PCNA, которая прикреплена к разрывам отстающей цепи, и катализирует образование фосфодиэфирных связей.
Эндонуклеаза лоскута 1 (FEN1 ) отвечает за обработку фрагментов Окадзаки. Он работает с ДНК-полимеразой для удаления праймера РНК из фрагмента Окадзаки и может удалять 5'-рибонуклеотид и 5'-створки, когда ДНК-полимераза смещает цепи во время синтеза отстающей цепи. Удаление этих лоскутов включает в себя процесс, называемый трансляцией псевдонима, и создает зарубку для лигирования. Таким образом, функция FEN1 необходима для созревания фрагмента Окадзаки при формировании длинной непрерывной цепи ДНК. Аналогичным образом, во время репарации оснований ДНК поврежденный нуклеотид перемещается в лоскут и впоследствии удаляется FEN1.
Эндонуклеаза Dna2 не имеет специфической структуры, и их свойства недостаточно хорошо описаны, но может быть названа одноцепочечной ДНК со свободными концами (оцДНК). Эндонуклеаза Dna2 необходима для расщепления длинных лоскутов ДНК, которые покидают FEN1 во время процесса Окадзаки. Эндонуклеаза Dna2 отвечает за удаление сегмента инициаторной РНК на фрагментах Окадзаки. Кроме того, эндонуклеаза Dna2 играет ключевую роль в промежуточных соединениях, образующихся в ходе различных метаболизмов ДНК, и выполняет функцию поддержания теломер.
Эндонуклеаза Dna2 становится активной, когда концевой сегмент РНК прикрепляется на 5 ’конце, потому что он перемещается в направлении от 5’ к 3 ’. В присутствии одноцепочечного ДНК-связывающего белка RPA 5'-створки ДНК становятся слишком длинными, и разрывы больше не подходят в качестве субстрата для FEN1. Это предотвращает удаление 5'-закрылков FEN1. Таким образом, роль Dna2 состоит в том, чтобы уменьшить 3'-конец этих фрагментов, делая возможным для FEN1 разрезать лоскуты и созревание фрагмента Okazaki более эффективно. В процессе Окадзаки геликаза ДНК2 и эндонуклеаза неразделимы. Эндонуклеаза Dna2 не зависит от структуры 5’-хвостовой вилки своей активности. Известно, что непродуктивное связывание создает блоки для расщепления и отслеживания FEN1. Известно, что АТФ снижает активность, но способствует высвобождению 3’-концевой метки. Исследования показали, что новая модель эндонуклеазы Dna2 и FEN1 частично ответственна за созревание фрагмента Окадзаки.
Недавно синтезированная ДНК, также известная как фрагменты Окадзаки, связывается ДНК-лигазой, который формирует новую цепь ДНК. При синтезе ДНК образуются две цепи. Ведущая цепь непрерывно синтезируется и удлиняется во время этого процесса, чтобы обнажить матрицу, которая используется для отстающей цепи (фрагменты Окадзаки). В процессе репликации ДНК праймеры ДНК и РНК удаляются из отстающей цепи ДНК, чтобы позволить фрагментам Окадзаки связываться. Поскольку этот процесс настолько распространен, созревание Окадзаки будет происходить около миллиона раз во время одного завершения репликации ДНК. Для созревания Окадзаки праймеры РНК должны создавать сегменты на фрагментах, которые необходимо лигировать. Он используется в качестве строительного блока для синтеза ДНК в отстающей цепи. На цепи шаблона полимераза будет синтезироваться в направлении, противоположном вилке репликации. Как только шаблон станет прерывистым, он создаст фрагмент Окадзаки. Дефекты созревания фрагментов Окадзаки могут потенциально вызывать разрыв цепей ДНК и вызывать различные формы хромосомных аномалий. Эти мутации в хромосомах могут повлиять на внешний вид, количество наборов или количество отдельных хромосом. Поскольку хромосомы фиксированы для каждого конкретного вида, это также может изменить ДНК и вызвать дефекты в генофонде этого вида.
Фрагменты Окадзаки присутствуют как в прокариотах, так и в эукариотах. Молекулы ДНК эукариот отличаются от кольцевых молекул прокариот тем, что они больше и обычно имеют несколько источников репликации. Это означает, что каждая эукариотическая хромосома состоит из множества реплицирующихся единиц ДНК с множеством источников репликации. Для сравнения, прокариотическая ДНК имеет только одну точку начала репликации. У эукариот эти реплицирующие вилки, которых много по всей ДНК, образуют «пузыри» в ДНК во время репликации. Репликационная вилка формируется в определенной точке, называемой автономно реплицирующимися последовательностями (ARS). У эукариот есть комплекс зажима-загрузчика и зажим из шести единиц, называемый ядерным антигеном пролиферирующих клеток. Эффективное движение репликационной вилки также критически зависит от быстрого размещения скользящих зажимов на вновь примированных сайтах на отстающей цепи ДНК с помощью АТФ-зависимых комплексов загрузчика зажимов. Это означает, что кусочная генерация фрагментов Окадзаки может идти в ногу с непрерывным синтезом ДНК на ведущей цепи. Эти комплексы с зажимом-загрузчиком характерны для всех эукариот и разделяют некоторые незначительные различия в синтезе фрагментов Окадзаки у прокариот и эукариот. Длина фрагментов Окадзаки у прокариот и эукариот также различается. У прокариот есть фрагменты Окадзаки, которые намного длиннее, чем у эукариот. У эукариот обычно есть фрагменты Окадзаки длиной от 100 до 200 нуклеотидов, тогда как фрагменты в прокариотической E. coli могут иметь длину 2000 нуклеотидов. Причина такого расхождения неизвестна.
Каждая эукариотическая хромосома состоит из множества реплицирующихся единиц ДНК с множеством источников репликации. Для сравнения, прокариотическая хромосома E. coli имеет только одну точку начала репликации. Репликация у прокариот происходит внутри цитоплазмы, и все это начинает репликацию, состоящую из примерно 100-200 или более нуклеотидов. Молекулы эукариотической ДНК имеют значительно большее количество репликонов, около 50 000 или более; однако репликация не происходит одновременно на всех репликонах. У эукариот репликация ДНК происходит в ядре. Множество репликаций формируется только в одной реплицирующейся молекуле ДНК, начало репликации ДНК смещается мультисубъединичным белком. Эта репликация медленная, иногда добавляется около 100 нуклеотидов в секунду.
Мы исходим из этого, что прокариотические клетки более просты по структуре, у них нет ядра, органелл и очень мало ДНК в виде одной хромосомы. Эукариотические клетки имеют ядро с несколькими органеллами и большим количеством ДНК, расположенных в линейных хромосомах. Мы также видим, что размер - еще одно различие между этими прокариотическими и эукариотическими клетками. Средняя эукариотическая клетка имеет примерно в 25 раз больше ДНК, чем прокариотическая клетка. В прокариотических клетках репликация происходит намного быстрее, чем в эукариотических клетках; бактерии иногда занимают всего 40 минут, а клетки животных - до 400 часов. У эукариот также есть особая операция по репликации теломер на конце их последних хромосом. Прокариоты имеют кольцевые хромосомы, не вызывающие синтеза концов. Прокариоты имеют непродолжительный непрерывный процесс репликации; эукариотические клетки, с другой стороны, осуществляют репликацию ДНК только во время S-фазы клеточного цикла.
Сходство - это этапы репликации ДНК. И у прокариот, и у эукариот репликация осуществляется путем раскручивания ДНК ферментом, называемым ДНК-геликазой. Новые нити создаются ферментами, называемыми ДНК-полимеразами. Оба они следуют похожей схеме, называемой полуконсервативной репликацией, при которой отдельные цепи ДНК производятся в разных направлениях, что создает ведущую и отстающую цепи. Эти отстающие нити синтезируются путем производства фрагментов Окадзаки, которые вскоре соединяются вместе. Оба этих организма начинают новые нити ДНК, которые также включают небольшие нити РНК.
Небольшая мутация в согласованных нуклеотидах может привести к хромосомным аберрациям и непреднамеренной генетической перестройке Хотя клетки проходят несколько этапов по порядку Чтобы гарантировать отсутствие мутаций в генетической последовательности, иногда специфические делеции и другие генетические изменения во время созревания фрагмента Окадзаки остаются незамеченными. Поскольку фрагменты Окадзаки представляют собой набор нуклеотидов для отстающей цепи, любое изменение, включая делеции, вставки или дупликации исходной цепи, может вызвать мутацию, если она не обнаружена и не зафиксирована. Другие причины мутаций включают проблемы с белками, которые помогают репликации ДНК. Например, мутация, связанная с примазой, влияет на удаление праймера РНК и может сделать цепь ДНК более хрупкой и уязвимой к разрывам. Другая мутация касается полимеразы α, которая нарушает редактирование последовательности фрагмента Окадзаки и включение белка в генетический материал. Оба изменения могут привести к хромосомным аберрациям, непреднамеренной генетической перестройке и различным видам рака в более позднем возрасте.
Чтобы проверить влияние белковых мутаций на живые организмы, исследователи генетически изменили лабораторных мышей, чтобы они были гомозиготными по другая мутация в белке, связанная с репликацией ДНК, эндонуклеазой лоскута 1 или FEN1. Результаты варьировались в зависимости от конкретных генных изменений. Гомозиготные нокаут-мутантные мыши испытали «неспособность пролиферации клеток» и «раннюю эмбриональную летальность» (27). Мыши с мутацией F343A и F344A (также известные как FFAA) умерли сразу после рождения из-за родовых осложнений, включая панцитопению и легочную гипоплазию. Это связано с тем, что мутация FFAA предотвращает взаимодействие FEN1 с PCNA (ядерным антигеном пролиферирующих клеток), что, следовательно, не позволяет ему выполнять свою задачу во время созревания фрагмента Окадзаки. Взаимодействие с этим белком считается ключевой молекулярной функцией в биологической функции FEN1. Мутация FFAA вызывает дефекты при удалении праймера РНК и репарации пар длинных оснований, что вызывает множество разрывов в ДНК. При тщательном наблюдении клетки, гомозиготные по мутациям FFAA FEN1, по-видимому, обнаруживают только частичные дефекты созревания, а это означает, что мыши, гетерозиготные по мутации, будут способны дожить до взрослого возраста, несмотря на наличие нескольких небольших трещин в своих геномах. Однако неизбежно эти разрывы препятствуют будущей репликации ДНК, поскольку разрыв вызывает коллапс репликационной вилки и вызывает двухцепочечные разрывы в реальной последовательности ДНК. Со временем эти зарубки также вызывают полные хромосомные разрывы, что может привести к серьезным мутациям и раку. Другие мутации были реализованы с измененными версиями полимеразы α, что привело к аналогичным результатам.
