Войти
Нокдаун гена - это экспериментальный метод, с помощью которого экспрессия одного или больше организмов генов сокращается. Снижение может происходить либо посредством генетической модификации, либо путем обработки реагентом, таким как короткая ДНК или РНК олигонуклеотид, который имеет последовательность, комплементарную либо гену, либо Транскрипт мРНК.
Если ДНК организма генетически модифицирована, полученный организм называется «нокдаун организмом». Если изменение экспрессии гена вызвано связыванием олигонуклеотида с мРНК или временным связыванием с геном, это приводит к временное изменение экспрессии гена, которое не модифицирует хромосомную ДНК, и результат называется «временный нокдаун».
При временном нокдауне связывание этого олигонуклеотида с активным геном или его транскриптами вызывает снижение экспрессии посредством различных процессов. Связывание может происходить либо через блокирование транскрипции (в случае связывания с геном), либо за счет деградации транскрипта мРНК (например, малой интерферирующей РНК (siRNA )) или РНКаза -H-зависимая антисмысловая система, или посредством блокирования сайтов мРНК трансляции, пре-m сплайсинга РНК, или сайты расщепления нуклеазой, используемые для созревания других функциональных РНК, включая миРНК (например, морфолино олигонуклеотидами или другими антисмысловыми антисмысловыми элементами, независимыми от РНКазы-H).
Наиболее прямое использование временных нокдаунов - это изучение гена, который был секвенирован, но имеет неизвестную или не полностью известную функцию. Этот экспериментальный подход известен как обратная генетика. Исследователи делают выводы из того, чем нокдаун отличается от людей, у которых работает интересующий ген. Временные нокдауны часто используются в биологии развития, поскольку олигонуклеотиды могут быть введены в одноклеточные зиготы и будут присутствовать в дочерних клетках инъецированной клетки через эмбриональный развитие. Термин "нокдаун гена" впервые появился в литературе в 1994 г.
РНК-интерференция (РНКи) - это средство подавления генов посредством деградации мРНК. Нокдаун гена этим методом достигается путем введения небольших двухцепочечных интерферирующих РНК (миРНК) в цитоплазму. Небольшие интерферирующие РНК могут происходить изнутри клетки или могут вводиться в клетку экзогенно. После введения в клетку экзогенные миРНК процессируются РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC ). МиРНК комплементарна целевой мРНК, которая должна быть заглушена, и RISC использует миРНК в качестве матрицы для определения местоположения целевой мРНК. После того, как RISC локализуется на целевой мРНК, РНК расщепляется рибонуклеазой.
РНКи широко используется в качестве лабораторного метода генетического функционального анализа. РНКи в таких организмах, как C. elegans и Drosophila melanogaster обеспечивает быстрое и недорогое средство исследования функции генов. В исследованиях C. elegans наличие таких инструментов, как библиотека Ahringer RNAi, дает лабораториям возможность тестировать многие гены в различных экспериментальных условиях. Информация, полученная в результате экспериментального использования РНКи, может быть полезна для определения потенциальных терапевтических целей, разработки лекарств или других приложений. РНК-интерференция - очень полезный инструмент исследования, позволяющий исследователям проводить обширные генетические скрининги, чтобы определить цели для дальнейших исследований, связанных с конкретным путем, лекарством или фенотипом.
Другой способ подавления экзогенной ДНК, который был обнаружен у прокариот, - это механизм с участием локусов, называемый «кластерные регулярные короткие палиндромные повторы» или CRISPR. Белки, называемые «CRISPR-ассоциированные гены» (cas-гены), кодируют клеточный аппарат, который разрезает экзогенную ДНК на небольшие фрагменты и вставляет их в локус повтора CRISPR. Когда эта CRISPR-область ДНК экспрессируется клеткой, малые РНК, полученные из экзогенных вставок ДНК, служат в качестве матричной последовательности, которую другие Cas-белки используют для подавления этой же экзогенной последовательности. Транскрипты коротких экзогенных последовательностей используются в качестве руководства, чтобы заглушить эти чужеродные ДНК, когда они присутствуют в клетке. Это служит своего рода приобретенным иммунитетом, и этот процесс подобен механизму интерференции прокариотической РНК. Повторы CRISPR консервативны среди многих видов и, как было продемонстрировано, могут использоваться в клетках человека, бактериях, C. elegans, рыбок данио и других организмов для эффективного манипулирования геномом. Использование CRISPR в качестве универсального исследовательского инструмента можно проиллюстрировать множеством исследований, в которых он используется для создания организмов с изменениями генома.
Другая технология, ставшая возможной благодаря манипуляциям с прокариотическим геномом, - это использование эффекторных нуклеаз, подобных активатору транскрипции (TALEN ), для нацеливания на определенные гены. TALEN - это нуклеазы, которые имеют два важных функциональных компонента: домен связывания ДНК и домен расщепления ДНК. Связывающий домен ДНК представляет собой последовательность-специфичную эффекторную последовательность, подобную активатору транскрипции, тогда как домен расщепления ДНК происходит от бактериальной эндонуклеазы и является неспецифическим. TALEN могут быть созданы для расщепления последовательности, определенной последовательностью эффекторной части конструкции, подобной активатору транскрипции. После создания TALEN вводится в клетку в виде плазмиды или мРНК. TALEN экспрессируется, локализуется в своей целевой последовательности и расщепляет определенный сайт. После расщепления целевой последовательности ДНК посредством TALEN клетка использует негомологичное соединение концов в качестве механизма репарации ДНК для коррекции расщепления. Попытка клетки восстановить расщепленную последовательность может сделать кодируемый белок нефункциональным, поскольку этот механизм репарации вносит ошибки вставки или удаления в репарированном сайте.
До сих пор нокдаун-организмы с постоянными изменениями в их ДНК создавались в основном для исследовательских целей. Также известные как нокдауны, эти организмы чаще всего используются для обратной генетики, особенно у таких видов, как мыши или крысы, для которых нелегко применить технологии временного нокдауна.
Есть несколько компаний, которые предлагают коммерческие услуги, связанные с лечением нокдауна генов.
