Войти
TILLING (Нацеливание на индуцированные локальные поражения в геномах ) - метод из молекулярная биология, которая позволяет направленную идентификацию мутаций в конкретном гене. TILLING был внедрен в 2000 г. на модельном заводе Arabidopsis thaliana. С тех пор пахота использовалась как метод обратной генетики для других организмов, таких как данио, кукуруза, пшеница, рис, соя, помидор и салат.
Метод сочетает в себе стандартный и эффективный метод мутагенеза с использованием химического вещества. мутаген, такой как этилметансульфонат (EMS), с помощью чувствительной методики скрининга ДНК, которая выявляет одноосновные мутации (также называемые точечными мутациями) в целевом гене. Метод TILLING основан на образовании гетеродуплексов ДНК , которые образуются, когда несколько аллелей амплифицируются с помощью ПЦР, а затем нагреваются и медленно охлаждаются. При несовпадении двух цепей ДНК образуется «пузырь », который затем расщепляется однонитевой нуклеазой. Затем продукты разделяются по размеру на нескольких разных платформах (см. Ниже).
Несоответствие может быть вызвано индуцированной мутацией, гетерозиготностью у одного человека или естественной изменчивостью между людьми.
EcoTILLING - это метод, использующий методы TILLING для поиска естественных мутаций у людей, обычно для анализа популяционной генетики. DEcoTILLING - это модификация TILLING и EcoTILLING, в которой используется недорогой метод идентификации фрагментов. С момента появления технологий секвенирования NGS, TILLING-by-секвенирование было разработано на основе секвенирования Illumina целевых генов, амплифицированных из многомерных объединенных шаблонов для выявления возможных однонуклеотидных изменений.
Существует несколько источников одноцепочечных нуклеаз. Первым широко используемым ферментом была нуклеаза маша, но было показано, что эта нуклеаза обладает высокой неспецифической активностью и работает только при низком pH, что может разрушать продукты ПЦР и праймеры, меченные красителем. Первоначальным источником однонитевой нуклеазы был CEL1 или CJE (экстракт сока сельдерея), но на рынок вышли и другие продукты, в том числе ферменты SNiPerase от Frontier Genomics, которые были оптимизированы для использования на платформах, использующих меченые и немеченые продукты ПЦР (см. следующий раздел). Transgenomic изолировал белок однонитевой нуклеазы и продает его как рекомбинантную форму. Преимущество рекомбинантной формы состоит в том, что, в отличие от смесей ферментов, она не содержит неспецифической нуклеазной активности, которая может разрушать красители на праймерах ПЦР. Недостаток - существенно более высокая стоимость.
В первой статье, описывающей TILLING, использовалась ВЭЖХ для идентификации мутаций (McCallum et al., 2000a). Способ стал более высокопроизводительным за счет использования рестрикционного фермента Cel-I в сочетании с системой на основе геля LICOR для выявления мутаций (Colbert et al., 2001). Преимущества использования этой системы заключаются в том, что сайты мутаций можно легко подтвердить и отличить от шума. Это связано с тем, что для прямой и обратной грунтовки можно использовать красители разного цвета. После того, как продукты расщепления были нанесены на гель, их можно будет просматривать в отдельных каналах, и, как и в случае с RFLP, размеры фрагментов в пределах дорожки в каждом канале должны составлять в сумме размер продукта полной длины. Преимущества системы LICOR - разделение больших фрагментов (~ 2 КБ), высокая производительность образцов (96 образцов, загруженных на бумажные гребенки) и бесплатное программное обеспечение для выявления мутаций (GelBuddy). Недостатки системы LICOR - необходимость заливки гелей для плит и длительное время работы (~ 4 часа). Методы TILLING и EcoTILLING теперь используются в капиллярных системах от Advanced Analytical Technologies, ABI и Beckman.
Для разделения продуктов ПЦР, не маркированных красителями, можно использовать несколько систем. Простые системы электрофореза в агарозе позволят разделить продукты расщепления недорого и со стандартным лабораторным оборудованием. Это было использовано для обнаружения SNP у кеты и получило название ДЕКОТИЛЛИНГ. Недостатком этой системы является меньшая разрешающая способность по сравнению с полиакриламидными системами. Elchrom Scientific продает гели Spreadex, которые являются сборными, могут иметь высокую пропускную способность и более чувствительны, чем стандартные полиакриламидные гели. Advanced Analytical Technologies Inc. продает флуоресцентную систему дцДНК AdvanCE FS96, которая представляет собой систему для 96 капиллярного электрофореза, которая имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами; включая способность разделять большие фрагменты (до 40 КБ), отсутствие необходимости в стадии обессоливания или осаждения, короткое время анализа (~ 30 минут), чувствительность к 5 мкг / мкл и отсутствие необходимости во флуоресцентно меченных праймерах.
В мире существует несколько центров обработки почвы, специализирующихся на выращивании сельскохозяйственных культур:
