Войти
Паттерны экспрессии генов регулируются как пространственно, так и временно в эмбрионах Drosophila melanogaster. Пространственно-временная экспрессия гена - это активация генов в определенных тканях организма в определенные моменты времени в течение развития. Паттерны активации генов сильно различаются по сложности. Некоторые из них просты и статичны, например, структура тубулина, которая экспрессируется во всех клетках во все времена жизни. С другой стороны, некоторые из них чрезвычайно сложны, их трудно предсказать и смоделировать, поскольку экспрессия сильно колеблется от минуты к минуте или от клетки к клетке. Пространственно-временные вариации играют ключевую роль в создании разнообразия типов клеток, обнаруженных в развитых организмах; поскольку идентичность клетки определяется набором генов, активно экспрессируемых в этой клетке, если экспрессия генов была однородной в пространстве и во времени, мог быть не более одного типа клетки.
Рассмотрим ген бескрылого, члена семейства генов wnt. На раннем этапе эмбрионального развития модельного организма Drosophila melanogaster, или плодовой мухи, wingless экспрессируется почти во всем эмбрионе чередующимися полосами, разделенными тремя клетками. Этот образец теряется к тому времени, когда организм превращается в личинку, но wingless все еще выражается в различных тканях, таких как крылья имагинальные диски, участки ткани, которые разовьются во взрослые крылья. пространственно-временной паттерн экспрессии гена wingless определяется сетью регуляторных взаимодействий, состоящих из эффектов многих различных генов, таких как even-skipped и Krüppel.
Что вызывает пространственные и временные различия в экспрессии одного гена? Поскольку текущие паттерны экспрессии строго зависят от предыдущих паттернов экспрессии, возникает регрессивная проблема объяснения того, что вызвало первые различия в экспрессии генов. Процесс, при котором однородная экспрессия генов становится пространственно и временной дифференциацией, известен как нарушение симметрии. Например, в случае эмбрионального развития дрозофилы гены nanos и bicoid асимметрично экспрессируются в ооците, потому что материнские клетки депонируют информационную РНК (мРНК) для этих генов на полюсах яйцо до того, как оно отложено.
Гамма-кристаллический промотор управляет экспрессией репортерного гена зеленого флуоресцентного белка исключительно в глазу взрослой лягушки. Один из способов идентифицировать паттерн экспрессии конкретного гена - разместить репортерный ген ниже промотора. В этой конфигурации промоторный ген будет вызывать экспрессию репортерного гена только там, где и когда экспрессируется интересующий ген. Распределение экспрессии репортерного гена можно определить путем его визуализации. Например, репортерный ген зеленый флуоресцентный белок можно визуализировать, стимулировав его синим светом, а затем используя цифровую камеру для записи зеленого флуоресцентного излучения.
Если промотор интересующего гена неизвестен, существует несколько способов определить его пространственно-временное распределение. Иммуногистохимия включает получение антитела со специфическим сродством к белку, связанному с интересующим геном. Затем это распределение этого антитела можно визуализировать с помощью такого метода, как флуоресцентное мечение. Иммуногистохимия имеет преимущества в том, что она методологически осуществима и относительно недорога. Его недостатки включают неспецифичность антитела, приводящую к ложноположительной идентификации экспрессии. Плохая проницаемость антитела в ткань-мишень может привести к ложноотрицательным результатам. Кроме того, поскольку иммуногистохимия визуализирует белок, генерируемый геном, если белковый продукт диффундирует между клетками или имеет особенно короткий или длительный период полужизни по сравнению с мРНК, которая используется для перевести белок, это может привести к искаженной интерпретации того, какие клетки экспрессируют мРНК.
гибридизации in situ генов, экспрессируемых в артериях (вверху) и венах (внизу) у рыбок данио. Окрашивание синим цветом указывает на присутствие мРНК гена. Панели слева - нормальные животные, а животные справа - мутировавшие в гене Notch. У рыб, лишенных Notch, на данный момент времени развития меньше артерий и больше вен. Гибридизация in situ представляет собой альтернативный метод, в котором «зонд» - синтетическая нуклеиновая кислота с последовательностью , комплементарный мРНК гена, добавляется к ткани. Затем этот зонд химически маркируется, чтобы его можно было визуализировать позже. Этот метод позволяет визуализировать именно мРНК-продуцирующие клетки без каких-либо артефактов, связанных с иммуногистохимией. Однако это общеизвестно сложно и требует знания последовательности из ДНК, соответствующей интересующему гену.
Метод, называемый скрининг энхансера-ловушки, выявляет разнообразие пространственно-временных паттернов экспрессии генов, возможных в организме. В этом методе ДНК, кодирующая репортерный ген, случайным образом вставляется в геном. В зависимости от промоторов гена , проксимальных к точке вставки, репортерный ген будет экспрессироваться в определенных тканях в определенные моменты развития. Хотя паттерны экспрессии, полученные от энхансера и ловушки, не обязательно отражают действительные паттерны экспрессии конкретных генов, они обнаруживают разнообразие пространственно-временных паттернов, доступных для эволюции.
Репортерные гены можно визуализировать в живых организмах, но и иммуногистохимия, и гибридизация in situ должны выполняться в фиксированных тканях. Методы, требующие фиксации ткани, могут создать только одну временную точку для отдельного организма. Однако использование живых животных вместо фиксированной ткани может иметь решающее значение для динамического понимания паттернов экспрессии на протяжении всей жизни человека. В любом случае, различия между людьми могут затруднить интерпретацию временных паттернов экспрессии.
В настоящее время разрабатываются несколько методов для контроля экспрессии генов в пространстве, времени и в различной степени. Один из методов заключается в использовании системы индуктор / репрессор оперона , которая обеспечивает временный контроль экспрессии гена. Для управления экспрессией генов в пространстве разрабатываются струйные принтеры для печати лигандов на гелевой культуре. Другой популярный метод включает использование света для пространственно-временного контроля экспрессии генов. Поскольку светом также можно легко управлять в пространстве, времени и степени, были разработаны и изучаются несколько методов контроля экспрессии генов на уровне ДНК и РНК. Например, РНК-интерференцию можно контролировать с помощью света, а также формирование паттерна экспрессии гена было выполнено в клеточном монослое и в эмбрионах рыбок данио с использованием клеточной морфолино или пептидной нуклеиновой кислоты, демонстрируя контроль гена. выражение пространственно-временное. Недавно был продемонстрирован контроль на основе света на уровне ДНК с использованием системы на основе трансгена или заключенных в клетки олигонуклеотидов, образующих триплекс
