Фиксация (гистология)

редактировать

В полях гистология, патология и ячейка биология, фиксация - это предохранение биологических тканей от разрушения вследствие автолиза или гниения. Он прекращает любые текущие биохимические реакции, а также может повысить механическую прочность или стабильность обработанных тканей. Фиксация ткани является критическим этапом при приготовлении гистологических срезов, ее широкая цель - сохранить клетки и компоненты ткани и сделать это таким образом, чтобы можно было получить тонкие окрашенные срезы. Это позволяет исследовать структуру тканей, которая определяется формой и размером таких макромолекул (внутри и вокруг клеток), как белки и нуклеиновые кислоты.

Содержание

  • 1 Цели
  • 2 Процесс
  • 3 Типа
  • 4 Химическая фиксация
    • 4.1 Сшивающие фиксаторы - альдегиды
    • 4.2 Осаждающие фиксаторы - спирты
    • 4.3 Окисляющие вещества
    • 4.4 Ртуть
    • 4.5 Пикраты
    • 4.6 Фиксатор HOPE
  • 5 Факторы, влияющие на фиксацию
    • 5.1 Кислотность или основность
    • 5.2 Осмолярность
    • 5.3 Размер образца
    • 5.4 Объем фиксатора
    • 5.5 Температура
    • 5.6 Продолжительность
    • 5.7 Время от удаления до фиксации
  • 6 Ссылки
  • 7 Внешние ссылки

Цели

Выполняя свою защитную роль, фиксаторы денатурируют белки путем коагуляции, образования дополнительных соединений или комбинации коагуляции и аддитивных процессов. Соединение, которое химически добавляется к макромолекулам, стабилизирует структуру наиболее эффективно, если оно способно объединяться с частями двух разных макромолекул - эффект, известный как сшивание. Фиксация ткани производится по нескольким причинам. Одна из причин - убить ткань, чтобы предотвратить посмертный распад (автолиз и гниение). Фиксация сохраняет биологический материал (ткань или клетки ) как можно ближе к его естественному состоянию в процессе подготовки ткани к исследованию. Для этого обычно необходимо выполнить несколько условий.

Во-первых, фиксатор обычно действует для отключения внутренних биомолекул, в частности, протеолитических ферментов, которые в противном случае переваривают или повреждают образец.

Во-вторых, фиксатор обычно защищает образец от внешних повреждений. Фиксирующие средства токсичны для большинства обычных микроорганизмов (в частности, бактерий ), которые могут присутствовать в образце ткани или которые иным образом могут колонизировать фиксированную ткань. Кроме того, многие фиксаторы химически изменяют фиксированный материал, делая его менее вкусным (неперевариваемым или токсичным) для условно-патогенных микроорганизмов.

Наконец, фиксаторы часто изменяют клетки или ткани на молекулярном уровне, повышая их механическую прочность или стабильность. Эта повышенная прочность и жесткость могут помочь сохранить морфологию (форму и структуру) образца во время его обработки для дальнейшего анализа.

Даже самая тщательная фиксация приводит к изменению образца и появлению артефактов, которые могут помешать интерпретации клеточной ультраструктуры. Ярким примером является бактериальная мезосома, которая в 1970-е годы считалась органеллой у грамположительных бактерий, но позже была продемонстрирована с помощью новых разработанных методов. для электронной микроскопии просто артефактом химической фиксации. Стандартизация фиксации и других процедур обработки тканей учитывает это появление артефактов, устанавливая, какие процедуры вводят какие виды артефактов. Исследователи, которые знают, какие типы артефактов следует ожидать от каждого типа ткани и техники обработки, могут точно интерпретировать участки с артефактами или выбрать методы, которые минимизируют артефакты в интересующих областях.

Процесс

Фиксация обычно является первым этапом многоступенчатого процесса подготовки образца биологического материала для микроскопии или другого анализа. Таким образом, выбор фиксатора и протокола фиксации может зависеть от дополнительных этапов обработки и запланированных окончательных анализов. Например, в иммуногистохимии используются антитела, которые связываются с конкретным белком-мишенью. Длительная фиксация может химически маскировать эти мишени и предотвращать связывание антител. В этих случаях обычно используется метод «быстрого исправления» с использованием холодного формалина в течение примерно 24 часов. Метанол (100%) также можно использовать для быстрой фиксации, и это время может варьироваться в зависимости от биологического материала. Например, MDA-MB 231 клетки рака груди человека можно фиксировать всего в течение 3 минут холодным метанолом (-20 ° C). Для исследований локализации ферментов ткани следует либо предварительно слегка зафиксировать, либо после фиксации после образования продукта активности фермента.

Типы

Обычно существует три типа процесса фиксации в зависимости от исходного образца:

Тепловая фиксация: После высыхания мазка при комнатной температуре предметное стекло захватывают щипцами или прищепкой и несколько раз пропускали через пламя горелки Бунзена, чтобы убить жар и прикрепить организм к предметному стеклу. Обычно используется с бактериями и археями. Тепловая фиксация обычно сохраняет общую морфологию, но не внутренние структуры. Тепло денатурирует протеолитический фермент и предотвращает автолиз. Тепловая фиксация не может использоваться в этом методе, поскольку тепловая фиксация приведет к сжатию или разрушению капсулы (гликокаликс ) и не будет видна на пятнах.

Погружение: Образец ткани погружают в фиксирующий раствор, объем которого минимум в 20 раз превышает объем фиксируемой ткани. Фиксатор должен диффундировать через ткань для фиксации, поэтому необходимо учитывать размер и плотность ткани, а также тип фиксатора. Это распространенный метод для сотовых приложений. Использование большего образца означает, что фиксатору требуется больше времени, чтобы достичь более глубоких тканей.

Перфузия: Фиксация через кровоток. Фиксатор вводится в сердце с объемом инъекции, соответствующим сердечному выбросу. Фиксатор распространяется по всему телу, и ткань не отмирает, пока не зафиксируется. Это дает преимущество в сохранении идеальной морфологии, но недостатком является то, что субъект умирает, а стоимость фиксатора, необходимого для более крупных организмов, высока.

Химическая фиксация

В процессах как иммерсионной, так и перфузионной фиксации химические фиксаторы используются для сохранения структур в состоянии (как химическом, так и структурном), максимально приближенном к живой ткани. Для этого требуется химический фиксатор.

Сшивающие фиксаторы - альдегиды

Сшивающие фиксаторы действуют путем создания ковалентных химических связей между белками в ткани. Это прикрепляет растворимые белки к цитоскелету и придает дополнительную жесткость ткани. Сохранение временной или тонкой структуры цитоскелета, такой как сокращения во время волн эмбриональной дифференцировки, лучше всего достигается предварительной обработкой с использованием микроволн перед добавлением перекрестно связывающего фиксатора.

Наиболее часто используемый фиксатор в гистологии это формальдегид. Обычно его используют в виде 10% нейтрального забуференного формалина (NBF), то есть прибл. 3,7–4,0% формальдегида в фосфатном буфере, pH 7. Поскольку формальдегид является газом при комнатной температуре, формалин - газообразный формальдегид, растворенный в воде (~ 37% мас. / Об.), - используется при приготовлении первого фиксатора. Формальдегид фиксирует ткань, сшивая белки, в первую очередь остатки основной аминокислоты лизина. Его эффекты обратимы при избытке воды, и он позволяет избежать пигментации формалином. Параформальдегид также широко используется и при нагревании деполимеризуется обратно в формалин, что также делает его эффективным фиксатором. Другие преимущества параформальдегида включают длительное хранение и хорошее проникновение в ткани. Это особенно хорошо для методов иммуногистохимии. Пары формальдегида также можно использовать в качестве фиксатора для мазков клеток.

Еще одним популярным альдегидом для фиксации является глутаральдегид. Он действует аналогично формальдегиду, вызывая деформацию α-спиралей белков. Однако глутаральдегид является более крупной молекулой, чем формальдегид, и поэтому проникает через мембраны медленнее. Следовательно, фиксация глутаральдегида на более толстых образцах тканей может быть затруднена; это можно устранить, уменьшив размер образца ткани. Одним из преимуществ фиксации глутарового альдегида является то, что он может давать более жесткий или прочно связанный фиксированный продукт - его большая длина и две альдегидные группы позволяют ему «соединять» и связывать более удаленные пары белковых молекул. Он вызывает быстрые и необратимые изменения, хорошо подходит для электронной микроскопии, хорошо работает при 4 ° C и дает наилучшие общие цитоплазматические и ядерные детали. Однако он не идеален для иммуногистохимического окрашивания.

Некоторые протоколы фиксации требуют комбинации формальдегида и глутарового альдегида, чтобы их силы дополняли друг друга.

Эти сшивающие фиксаторы, особенно формальдегид, имеют тенденцию сохранять вторичную структуру белков, а также могут сохранять большую часть третичной структуры.

Осаждающие фиксаторы - спирты

Осаждающие (или денатурирующие) фиксаторы действуют, снижая растворимость белковых молекул и часто нарушая гидрофобные взаимодействия, которые придают многим белкам их третичную структуру. осаждение и агрегация белков - это процесс, сильно отличающийся от сшивки, которая происходит с альдегидными фиксаторами.

Наиболее распространенными осаждающими фиксаторами являются этанол и метанол. Их обычно используют для исправления замороженных срезов и мазков. Также используется ацетон, и было показано, что он обеспечивает лучшую гистологическую сохранность, чем замороженные срезы при использовании в методике ацетон-метилбензоат-ксилола (AMEX).

Метанол, этанол и ацетон, денатурирующие белок, редко используются отдельно для фиксации блоков, если не исследуются нуклеиновые кислоты.

Уксусная кислота представляет собой денатурирующий агент, который иногда используется в сочетании с другими осаждающими фиксаторами, такими как AFA Дэвидсона. Известно, что спирты сами по себе вызывают значительное сжатие и затвердевание ткани во время фиксации, в то время как одна уксусная кислота вызывает набухание ткани; их сочетание может привести к лучшему сохранению ткани морфологии.

Окисляющих агентов

Окисляющие фиксаторы могут реагировать с боковыми цепями белков и других биомолекул, позволяя образовывать поперечные связи, которые стабилизируют структуру ткани. Однако они вызывают обширную денатурацию, несмотря на сохранение тонкой клеточной структуры, и используются в основном в качестве вторичных фиксаторов.

Тетроксид осмия часто используется в качестве вторичного фиксатора при подготовке образцов для электронной микроскопии. (Он не используется для световой микроскопии, так как очень плохо проникает в толстые участки ткани.)

Дихромат калия, хромовая кислота и перманганат калия находят применение в определенные специфические гистологические препараты.

Меркуриалы

Меркуриалы, такие как B-5 и фиксатор Ценкера, обладают неизвестным механизмом, который увеличивает яркость окрашивания и дает отличную детализацию ядер. Несмотря на свою скорость, ртутные вещества плохо проникают в ткань и вызывают усадку. Лучшее их применение - фиксация кроветворных и ретикулоэндотелиальных тканей. Также обратите внимание, что, поскольку они содержат ртуть, при утилизации необходимо соблюдать осторожность.

Пикраты

Пикраты хорошо проникают в ткани, вступают в реакцию с гистонами и основными белками с образованием кристаллических пикратов с аминокислотами и осаждением всех белков. Он является хорошим фиксатором для соединительной ткани, хорошо сохраняет гликоген и извлекает липиды, что дает лучшие результаты по сравнению с формальдегидом при иммуноокрашивании биогенных и полипептидных гормонов. Однако он вызывает потерю базофилов, если образец не будет тщательно промыт после фиксации.

Фиксатор HOPE

Эффект защиты органических растворителей, опосредованный буфером Hepes-глутаминовой кислоты (HOPE), придает формалино-подобную морфологию, отличное сохранение белковых антигенов для иммуногистохимии и гистохимии ферментов, хорошие выходы РНК и ДНК и отсутствие сшивающих белков.

Факторы, влияющие на фиксацию

Кислотность или основность

Следует поддерживать в физиологическом диапазоне между pH 4-9. PH для сохранения ультраструктуры должен находиться в диапазоне от 7,2 до 7,4

Осмолярность

Гипертонические растворы вызывают сокращение клеток.

Гипотонические растворы приводят к набуханию клеток и плохой фиксации.

10% нейтральный буферный формалин представляет собой 4% формальдегида (1,33 осмолярного) в буфере PBS (0,3 осмолярного) в сумме до 1,63 осмолярности. Это очень гипертонический раствор, но в течение многих лет он хорошо зарекомендовал себя в качестве общего условия фиксации тканей в патологических лабораториях. Размер ткани также может повлиять на процесс фиксации.

Размер образца

1–4 мм, толщина [0,5 см]

Объем фиксатора

По крайней мере в 15-20 раз больше, чем ткань объем

Температура

Повышение температуры увеличивает скорость фиксации. Однако следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить приготовления образца. Обычно фиксация проводится при комнатной температуре.

Продолжительность

Как правило, через 1 час на миллиметр ткани параформальдегид (PFA) должен проникнуть. Таким образом, если у нас есть трехмерный тканевой блок, время фиксации определяется кратчайшим размером.

Время от удаления до фиксации

Фиксация - это химический процесс, и нужно время для его завершения. Хотя «чрезмерная фиксация» может быть вредной, недостаточная фиксация в последнее время была признана серьезной проблемой и может быть причиной несоответствующих результатов для некоторых анализов.

Ссылки

Внешние ссылки

Последняя правка сделана 2021-05-20 07:38:00
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте