Войти
Кристаллы белков, выращенных на космических кораблях US Space Shuttle или Russian Космическая станция, Мир.Кристаллизация белка - это процесс образования регулярного массива отдельных белковых молекул, стабилизированных кристаллическими контактами. Если кристалл достаточно упорядочен, он будет дифрагировать. Некоторые белки естественным образом образуют кристаллические массивы, такие как аквапорин в хрусталике глаза.
В процессе кристаллизации белка белки растворяются в водной среде и растворе пробы, пока не достигнут перенасыщенное состояние. Для достижения этого состояния используются различные методы, такие как диффузия пара, микродиализ, микродиализ и диффузия через свободный интерфейс. Развитие кристаллов протеина - сложный процесс, на который влияют многие факторы, включая pH, температуру, ионную силу в растворе для кристаллизации и даже гравитацию. После образования эти кристаллы могут быть использованы в структурной биологии для изучения молекулярной структуры белка, в частности, для различных промышленных или медицинских целей.
Более 150 лет ученые знали кристаллизации белковых молекул.
Кристаллы гемоглобина SC, наблюдаемые под микроскопом. В 1840 году Фридрих Людвиг Хюнефельд случайно обнаружил образование кристаллического материала в образцах крови дождевых червей, помещенных под двумя предметными стеклами, и иногда наблюдал небольшие пластинчатые кристаллы в высушенных образцах крови свиней или человека.. Эти кристаллы были названы «гемоглобином» Феликсом Хоппе-Сейлером в 1864 году. Основополагающие открытия Хюнефельда вдохновили многих ученых в будущем.
В 1851 году Отто Функе описал процесс получения кристаллов человеческого гемоглобина путем разбавления красные кровяные тельца с растворителями, такими как чистая вода, спирт или эфир, с последующим медленным испарением растворителя из белкового раствора. В 1871 году профессор Йенского университета Уильям Т. Прейер опубликовал книгу под названием Die Blutkrystalle (Кристаллы крови), в которой рассмотрел особенности кристаллов гемоглобина примерно 50 видов млекопитающих, птиц, рептилий и рыб.
В 1909 году физиолог Эдвард Т. Райхерт вместе с минералогом Амосом П. Брауном опубликовали трактат о получении, физиологии и геометрических характеристиках кристаллов гемоглобина нескольких сотен животных, включая вымершие виды, такие как тасманский волк. Были обнаружены увеличивающиеся кристаллы белка.
В 1934 году Джон Десмонд Бернал и его ученица Дороти Ходжкин обнаружили, что кристаллы белка, окруженные их маточным раствором, дают лучшие дифракционные картины, чем высушенные кристаллы. Используя пепсин, они первыми смогли различить дифрактограмму влажного глобулярного белка. До Бернала и Ходжкина кристаллография белков выполнялась только в сухих условиях с противоречивыми и ненадежными результатами. Это первая рентгенограмма кристалла белка.
В 1958 г. Джон впервые сообщил о структуре миоглобина (красный белок, содержащий гем), определенном с помощью рентгеновской кристаллографии. Кендрю. Кендрю разделил Нобелевскую премию по химии 1962 года с Максом Перуцем за это открытие.
Теперь, основываясь на кристаллах белка, их структуры играют важную роль в биохимия и трансляционная медицина.
Кристаллы лизоцима, наблюдаемые через поляризационный фильтр. Суть образования кристаллов заключается в том, чтобы раствор образца достиг пересыщенное состояние. Перенасыщение определено McPherson et al. 2014 как «неравновесное состояние, при котором некоторое количество макромолекулы, превышающее предел растворимости, при определенных химических и физических условиях, тем не менее, присутствует в растворе». Образование твердых частиц в растворе, таких как агрегаты и кристаллы, способствует восстановлению равновесия. Система хочет восстановить равновесие, чтобы каждый компонент в выражении энергии был минимальным. В выражение энергии входят три основных фактора: энтальпия (∆H), энтропия (∆S) и температура (T). ∆H в этом выражении относится к ∆H химических связей, которые образуются и разрываются в результате реакций или фазовых переходов. ∆S относится к степени свободы или измерению неопределенности, которую могут иметь молекулы. Спонтанность процесса, свободная энергия Гибба (∆G), определяется как ∆G = ∆H- T∆S. Следовательно, либо увеличение ∆S, либо уменьшение ∆H способствует спонтанности всего процесса, делая ∆G более отрицательным, таким образом достигая минимального энергетического состояния системы. При образовании кристаллов молекулы белка становятся более упорядоченными, что приводит к уменьшению ∆S и делает ∆G более положительным. Следовательно, для спонтанной кристаллизации требуется достаточно отрицательный ∆H, чтобы преодолеть потерю энтропии в более упорядоченной системе.
Для образования кристаллов требуется два этапа: зарождение и рост. Зарождение зародышей - это этап инициации кристаллизации. На стадии зародышеобразования молекулы белка в растворе объединяются в агрегаты, образуя стабильное твердое ядро. По мере образования ядра кристалл становится все больше и больше за счет молекул, прикрепленных к этому стабильному ядру. Стадия зародышеобразования имеет решающее значение для образования кристаллов, поскольку это фазовый переход первого рода образцов, переходящих от высокой степени свободы к упорядоченному состоянию (от водного к твердому). Для успешного проведения стадии зародышеобразования необходимо изменение параметров кристаллизации. Подход, лежащий в основе кристаллизации белка, заключается в снижении растворимости целевого белка в растворе. Когда предел растворимости превышен и кристаллы присутствуют, кристаллизация завершается.
Три метода получения кристаллов, A: висящая капля. B: Падение сидя. C: Микродиализ Диффузия пара является наиболее часто используемым методом кристаллизации белка. В этом методе капли, содержащие очищенный белок, буфер и осадитель, попадают в резервуар большего размера, содержащий аналогичные буферы и осадители в более высоких концентрациях. Первоначально капля белкового раствора содержит сравнительно низкие концентрации осадителя и белка, но по мере уравновешивания капли и резервуара концентрации осадителя и белка в капле увеличиваются. Если для данного белка используются соответствующие растворы для кристаллизации, в капле происходит рост кристаллов. Этот метод используется, потому что он позволяет мягко и постепенно изменять концентрацию белка и концентрацию осадителя, что способствует росту крупных и хорошо упорядоченных кристаллов.
Диффузия пара может быть выполнена как висячий, так и в вертикальном формате. Аппарат "висящая капля" включает каплю раствора белка, помещенную на перевернутое покровное стекло, которое затем подвешивается над резервуаром. Аппарат для кристаллизации сидя-капля помещает каплю на пьедестал, отделенный от резервуара. Оба этих метода требуют герметизации окружающей среды, чтобы могло произойти уравновешивание между каплей и резервуаром.
Микродозирование обычно включает погружение очень небольшого объема капель белка в масло (как можно меньше как 1 мкл). Причина, по которой требуется масло, заключается в том, что используется такой малый объем белкового раствора и, следовательно, необходимо предотвратить испарение для проведения эксперимента в водном режиме. Хотя можно использовать различные масла, два наиболее распространенных герметика - это парафиновые масла (описанные Chayen et al.) И силиконовые масла (описанные D’Arcy). Существуют также другие методы микродозирования, в которых не используется жидкий герметизирующий агент, а вместо этого требуется, чтобы ученый быстро наклеил пленку или ленту на пластину с отверстиями после помещения капли в лунку.
Помимо очень ограниченного количества необходимого образца, этот метод также имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что образцы защищены от загрязнения воздухом, поскольку они никогда не подвергаются воздействию воздуха во время эксперимента.
Микродиализ использует полупроницаемую мембрану, через которую могут проходить небольшие молекулы и ионы, в то время как белки и крупные полимеры не могут проходить. Устанавливая градиент концентрации растворенного вещества на мембране и позволяя системе двигаться к равновесию, система может медленно двигаться в сторону перенасыщения, при котором могут образовываться кристаллы белка.
Микродиализ может производить кристаллы путем высаливания с использованием высоких концентраций соли или других небольших проницаемых для мембран соединений, которые снижают растворимость белка. В очень редких случаях некоторые белки могут кристаллизоваться путем диализа, солей, диализа против чистой воды, удаления растворенных веществ, самоассоциации и кристаллизации.
Этот метод объединяет белковые и осаждающие растворы без их предварительного смешивания, а вместо этого вводит их через обе стороны канала, обеспечивая равновесие за счет диффузии. Два раствора вступают в контакт в камере для реагентов, оба при максимальной концентрации, инициируя спонтанное зародышеобразование. Когда система приходит в равновесие, уровень перенасыщения уменьшается, способствуя росту кристаллов.
Основной движущей силой кристаллизации белка является оптимизация количество связей, которые можно образовать с другим белком посредством межмолекулярных взаимодействий. Эти взаимодействия зависят от электронной плотности молекул и боковых цепей белка, которые изменяются в зависимости от pH. Третичная и четвертичная структура белков определяется межмолекулярными взаимодействиями между боковыми группами аминокислот, при которых гидрофильные группы обычно обращены наружу к раствору, образуя гидратную оболочку для растворителя (воды). При изменении pH заряд на этих полярных боковых группах также изменяется в зависимости от pH раствора и pKa белка. Следовательно, выбор pH важен либо для содействия образованию кристаллов, где связь между молекулами друг с другом более благоприятна, чем с молекулами воды. pH - одна из самых мощных манипуляций, которые можно назначить для оптимальных условий кристаллизации.
Температура - еще один интересный параметр для обсуждения, поскольку растворимость белка является функцией температуры. При кристаллизации белка одной из распространенных стратегий является изменение температуры для получения успешных кристаллов. В отличие от pH, температура различных компонентов кристаллографических экспериментов может повлиять на конечные результаты, такие как температура приготовления буфера, температура фактического эксперимента по кристаллизации и т. Д.
Химические добавки небольшие химические соединения, которые добавляют в процессе кристаллизации для увеличения выхода кристаллов. Роль малых молекул в кристаллизации белка вначале не была хорошо продумана, поскольку в большинстве случаев они рассматривались как загрязнители. Меньшие молекулы кристаллизуются лучше, чем макромолекулы, такие как белки, поэтому использование химических добавок было ограничено до исследования Макферсона. Тем не менее, это важный аспект экспериментальных параметров кристаллизации, который важен для биохимиков и кристаллографов для дальнейшего изучения и применения.
Существуют высокопроизводительные методы, которые помогают упростить большое количество экспериментов, необходимых для изучения различных условий, необходимых для успешного роста кристаллов. Для заказа доступны многочисленные коммерческие наборы, в которых предварительно собранные ингредиенты используются в системах, гарантирующих успешную кристаллизацию. Используя такой набор, ученый избегает хлопот по очистке белка и определению подходящих условий кристаллизации.
Обработка жидкостей роботов можно использовать для настройки и автоматизации большого количества экспериментов по кристаллизации одновременно. То, что в противном случае было бы медленным и потенциально подверженным ошибкам процессом, выполняемым человеком, может быть выполнено эффективно и точно с помощью автоматизированной системы. В роботизированных системах кристаллизации используются те же компоненты, которые описаны выше, но каждый этап процедуры выполняется быстро и с большим количеством повторов. В каждом эксперименте используются крошечные количества раствора, причем меньший размер имеет двойное преимущество: меньшие размеры образцов не только сокращают расход очищенного белка, но и меньшие количества раствора приводят к более быстрой кристаллизации. За каждым экспериментом следит камера, которая определяет рост кристаллов.
Белки могут быть сконструированы таким образом, чтобы повысить вероятность успешной кристаллизации белка с помощью таких методов, как уменьшение поверхностной энтропии или инженерия контактов кристаллов. Часто проблемные остатки цистеина можно заменить аланином, чтобы избежать агрегации, опосредованной дисульфидом, а остатки, такие как лизин, глутамат и глутамин, можно заменить на аланин для снижения внутренней гибкости белка. которые могут препятствовать кристаллизации.
Макромолекулярные структуры могут быть определены из кристаллов белка с использованием различных методов, включая дифракцию рентгеновских лучей / кристаллографию рентгеновских лучей, Криогенная электронная микроскопия (CryoEM) (включая Электронная кристаллография и Дифракция электронов на микрокристаллах (MicroED) ), Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронная дифракция. См. Также Структурная биология.
Кристаллизация белков также может быть полезна при составлении белков для фармацевтических целей.
