Войти
A Бесклеточная система - это инструмент in vitro, широко используемый для изучения биологические реакции, которые происходят внутри клеток, кроме полной клеточной системы, что снижает сложные взаимодействия, обычно наблюдаемые при работе в целой клетке. Субклеточные фракции могут быть выделены с помощью ультрацентрифугирования для обеспечения молекулярного механизма, который можно использовать в реакциях в отсутствие многих других клеточных компонентов. Эукариотическая и прокариотическая клетка внутренние компоненты были использованы для создания этих упрощенных сред. Эти системы позволили появиться бесклеточной синтетической биологии, обеспечивая контроль над тем, какая реакция исследуется, а также ее результативность, и уменьшая количество соображений, которые обычно возникают при работе с более чувствительными живыми клетками.
Бесклеточные системы можно разделить на две основные классификации: на основе клеточного экстракта, которые удаляют компоненты из всей клетки для внешнего использования, и очищенные ферментные на основе, которые используют очищенные компоненты молекул, которые, как известно, участвуют в данном процессе. Типы на основе клеточных экстрактов подвержены таким проблемам, как быстрое разложение компонентов вне их хозяина, как показано в исследовании Kitaoka et al. где бесклеточная система трансляции, основанная на Escherichia coli (E. coli), типа клеточного экстракта, имела матрицу мРНК очень быстро деградировать и привел к остановке синтеза белка.
Способы получения варьируются в зависимости от ситуаций обоих типов бесклеточных систем.
Нобелевский лауреат Эдуард Бюхнер, возможно, был первым, кто представил бесклеточную систему с использованием дрожжевых экстрактов, но с тех пор потом были найдены альтернативные источники. E. coli, зародыши пшеницы и ретикулоциты кролика доказали свою полезность для создания бесклеточных систем путем экстракции их внутренних компонентов. Экстракты E. coli 30S получали, например, измельчением бактерий с оксидом алюминия с последующей очисткой. Точно так же зародыши пшеницы измельчали с промытым кислотой песком или порошковым стеклом, чтобы вскрыть клеточные мембраны. Ретикулоциты кроликов были лизированы в растворе MgCl 2, а экстракт отфильтровали от мембран центрифугированием.
Биосистемы бесклеточного синтетического пути биотрансформации можно получить путем смешивания ряда очищенных ферментов и коферментов. Например, компактные и высокоактивные биосистемы были экстрагированы и очищены из E. coli с помощью сахарозы- центрифугирования в градиенте плотности.
Биосистемы биотрансформации бесклеточного пути синтеза предлагаются в качестве новая недорогая платформа для биопроизводства по сравнению с микробной ферментацией, используемой в течение тысяч лет. Бесклеточные биосистемы имеют несколько преимуществ, подходящих для промышленного применения:
Биосистемы in vitro можно легко контролировать и получать доступ без мембраны. Примечательно, что в работе, ведущей к Нобелевской премии, в эксперименте Ниренберга и Маттеи использовалась бесклеточная система типа клеточного экстракта для включения выбранных аминокислот, помеченных радиоактивно в синтезированные белки с помощью 30S, экстрагированного из E. coli. Более поздние исследования, такие как исследование, проведенное Spirin et al. с прокариотической и эукариотической версиями их бесклеточной системы трансляции, также синтезировали белки с увеличенным производством, используя такие методы, как непрерывный поток для добавления материалов и удаления продуктов. С такими достижениями в урожайности были расширены приложения для повышения продуктивности, такие как синтез гибридных белков, которые потенциально могут служить вакцинами от B-клеточных лимфом. Кроме того, бесклеточный синтез белка становится новой альтернативой для быстрого синтеза белка.
Разработка метаболических процессов была достигнута с помощью бесклеточных систем. Bujara et al., Например, смогли использовать гликолитические сетевые экстракты, состоящие из ферментов из E. coli, которые продуцируют дигидроксиацетонфосфат, для анализа в реальном времени концентрации метаболита при изменении уровня фермента, с конечным результатом оптимального производства дигидроксиацетонфосфата. Кроме того, Калхун и Шварц смогли использовать гликолитический промежуточный продукт для подпитки бесклеточной системы, что позволило относительно недорого генерировать АТФ по сравнению с использованием реагентов в реакции фосфоенолпирувата.
Бесклеточные системы также использовались для включения неприродных аминокислот. Shimizu et al. смогли изменить стоп-кодон на смысловой кодон путем исключения фактора высвобождения RF1 , что указывает на способность вставлять желаемые аминокислоты в неестественных ситуациях. Это используется в системах, где работа внутри клетки проблематична, например, процесс метаболизма аминокислот, предотвращающий специфическое мечение аминокислот, которое было бы полезно в многомерной ЯМР-спектроскопии. Кигава и др. Смогли успешно пометить аминокислоты в бесклеточной системе, в которой метаболизм аминокислот больше не присутствовал, что сделало такие системы полезными для исследований ЯМР.
