Войти
Дифференциальное центрифугирование Дифференциальное центрифугирование (также известное как центрифугирование с дифференциальной скоростью ) является обычной процедурой в биохимии и клеточной биологии, которая используется для разделения органелл и других субклеточных частиц на основе их скорости оседания. Хотя дифференциальное центрифугирование часто применяется в биологическом анализе, оно является общим методом, также подходящим для грубой очистки неживых взвешенных частиц (например, наночастиц, коллоидных частиц, вирусов ). В типичном случае, когда дифференциальное центрифугирование используется для анализа клеточно-биологических явлений (например, распределения органелл), образец ткани сначала лизируется для разрушения клеточных мембран и высвободить органеллы и цитозоль. Затем лизат подвергают повторным центрифугированию, при котором частицы, которые достаточно быстро осаждаются при заданной центробежной силе в течение заданного времени, образуют компактный «осадок» на дне пробирки для центрифугирования.
После каждого центрифугирования супернатант (не осажденный раствор) удаляют из пробирки и повторно центрифугируют при увеличенной центробежной силе и / или увеличении времени. Дифференциальное центрифугирование подходит для разделения сырой нефти на основе скорости осаждения, но более мелкозернистая очистка может быть проведена на основе плотности посредством центрифугирования в равновесном градиенте плотности. Таким образом, метод дифференциального центрифугирования представляет собой последовательное осаждение частиц из предыдущего супернатанта с использованием все более высоких сил центрифугирования. Клеточные органеллы, разделенные с помощью дифференциального центрифугирования, поддерживают относительно высокую степень нормального функционирования, если они не подвергаются денатурирующим условиям во время выделения.
В вязкой жидкости скорость осаждения данной взвешенной частицы ( пока частица более плотная, чем жидкость) в значительной степени зависит от следующих факторов:
Более крупные частицы оседают быстрее и при меньших центробежных силах. Если частица менее плотная, чем жидкость (например, жиры в воде), частица не будет осаждаться, а скорее будет плавать, независимо от силы перегрузки, испытываемой частицей. Центробежная сила разделяет компоненты не только по плотности, но также по размеру и форме частиц. Напротив, более специализированное центрифугирование в равновесном градиенте плотности дает профиль разделения, зависящий только от плотности частиц, и поэтому подходит для более мелкозернистого разделения.
Высокая перегрузка делает осаждение мелких частиц намного быстрее, чем броуновская диффузия, даже для очень мелких (наноразмерных) частиц. При использовании центрифуги закон Стокса необходимо модифицировать, чтобы учесть изменение силы перегрузки в зависимости от расстояния от центра вращения.
где
Дифференциальное центрифугирование может использоваться с интактными частицами (например, биологическими клетками, микрочастицами, наночастицами) или используется для разделения составных частей данной частицы. Используя пример отделения эукариотических органелл от интактных клеток, клетка должна быть сначала лизирована и гомогенизирована (в идеале с помощью щадящей техники, такой как гомогенизация Даунса; более жесткие методы или чрезмерная гомогенизация приведут к снижению доли интактных органелл). После получения неочищенного экстракта органелл его можно подвергнуть центрифугированию с различными скоростями для разделения органелл:
| Ввод образца | G force | Время | Необходимый инструмент | Содержимое гранул | Содержимое супернатанта |
|---|---|---|---|---|---|
| Нелизированные (эукариотические) клетки | 100 xg | 5 мин. | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с качающимся баком | Интактные (эукариотические) клетки, макроскопический мусор | Зависит от на образце |
| Осторожно лизированные клетки (например, гомогенизатор Даунса) | 600 xg | 10 мин | Настольная центрифуга с фиксированным углом или центрифуга с качающимся баком | Ядра | Цитозоль, неядерные органеллы |
| Надосадочная жидкость предыдущего ряда | 15000 xg | 20 мин | Настольная центрифуга с фиксированным углом | Митохондрии, хлоропласты, лизосомы, пероксисомы | Цитозоль, микросомы (известный как пост-митохондриальный супернатант) |
| Супернатант предыдущего ряда | 50,000 xg - 100,000 xg | 60 минут | Высокоскоростная центрифуга с фиксированным углом или вакуумная ультрацентрифуга | Плазматическая мембрана, микросомальная фракция, большие полирибосомы | Цитозоль, рибосомные субъединицы, маленькие полирибосомы, ферментные комплексы |
| Супернатант предыдущего ряда | 50 000 xg - 100 000 xg | 120 мин. | Вакуумная ультрацентрифуга | Рибосомные субъединицы, небольшие полирибосомы, некоторые растворимые ферментные комплексы | Цитозоль |
Лизированный Теперь образец готов к центрифугированию в ультрацентрифуге. Ультрацентрифуга состоит из охлаждаемой камеры низкого давления, содержащей ротор, который приводится в движение электродвигателем, способным к высокоскоростному вращению. Образцы помещают в пробирки внутри ротора или прикрепляют к нему. Скорость вращения может достигать 100 000 об / мин для напольной модели, 150 000 об / мин для настольной модели (Beckman Optima Max-XP или Sorvall MTX150), создавая центробежные силы скорости от 800 000 до 1 000 000 g. Эта сила вызывает осаждение макромолекул и может даже вызывать неравномерное распределение небольших молекул.
Поскольку разные фрагменты клетки имеют разные размеры и плотность, каждый фрагмент осаждается в осадок. с разными минимальными центробежными силами. Таким образом, разделение образца на разные слои может быть выполнено путем сначала центрифугирования исходного лизата при слабых силах, удаления осадка и последующего воздействия на последующие супернатанты последовательно большего центробежного поля. Каждый раз порция разной плотности оседает на дно контейнера и извлекается, а повторное нанесение создает ряд слоев, включающих различные части исходного образца. Могут быть предприняты дополнительные шаги для дальнейшей очистки каждой из полученных гранул.
Осаждение зависит от массы, формы и частичного удельного объема макромолекулы, а также от плотности растворителя, размера ротора и скорости вращения. Скорость седиментации можно контролировать во время эксперимента для расчета молекулярной массы. Значения коэффициента седиментации (S) могут быть рассчитаны. Большие значения S (более высокая скорость седиментации) соответствуют большей молекулярной массе. Плотные частицы осаждаются быстрее. Удлиненные белки имеют больший коэффициент трения и медленнее осаждаются для обеспечения точности.
Различие между методами дифференциального центрифугирования и центрифугирования в градиенте плотности заключается в том, что в последнем методе используются растворы различной плотности (например, сахароза, фиколл) или гели, через которые образец проходит. Это разделяет образец на слои по относительной плотности, основываясь на том принципе, что молекулы оседают под действием центробежной силы, пока не достигнут среды с такой же плотностью, как у них. Степень разделения или количество слоев зависит от раствора или геля. Дифференциальное центрифугирование, с другой стороны, не использует градиент плотности, и центрифугирование происходит с возрастающей скоростью. Различная скорость центрифугирования часто приводит к разделению не более чем на две фракции, поэтому супернатант может быть разделен на дополнительных этапах центрифугирования. Для этого на каждом этапе скорость центрифугирования необходимо увеличивать до тех пор, пока не будут отделены желаемые частицы. Напротив, центрифугирование в градиенте плотности обычно выполняется только с одной скоростью центрифугирования.
