Войти
Массивное параллельное секвенирование сигнатур ( MPSS) - это процедура, которая используется для идентификации и количественной оценки транскриптов мРНК, приводящая к данным, аналогичным последовательному анализу экспрессии генов (SAGE), хотя в нем используется ряд существенно отличающихся друг от друга этапов биохимии и секвенирования.
MPSS - это метод определения уровней экспрессии мРНК путем подсчета количества отдельных молекул мРНК, продуцируемых каждым геном. Это «открытый конец» в том смысле, что идентичность РНК, подлежащих измерению, не предопределена заранее, как это происходит с микрочипами экспрессии генов.
Образец мРНК сначала преобразуется в комплементарную ДНК ( кДНК ) с помощью обратной транскриптазы, что упрощает последующие манипуляции. Эти кДНК сливаются с небольшой олигонуклеотидной «меткой», которая позволяет амплифицировать кДНК с помощью ПЦР и затем связывать ее с микрогранулами. После нескольких раундов определения последовательности с использованием гибридизации флуоресцентно меченных зондов для каждой гранулы определяют сигнатуру последовательности ~ 16-20 п.н. Флуоресцентное изображение фиксирует сигнал от всех шариков, будучи прикрепленным к двумерной поверхности, поэтому последовательности ДНК определяются для всех шариков параллельно. Происходит некоторая амплификация исходного материала, поэтому в конце за эксперимент получается примерно 1 000 000 считываний последовательностей.
MPSS позволяет идентифицировать транскрипты мРНК посредством генерации сигнатурной последовательности 17–20 п.н. ( пары оснований ), соседней с 3'-концом самого 3'-сайта указанного рестрикционного фермента (обычно Sau3A или DpnII ). Каждая сигнатурная последовательность клонируется на один из миллиона микрогранул. Этот метод гарантирует, что на микробусинке находится только один тип последовательности ДНК. Таким образом, если в биологическом образце имеется 50 копий определенного транскрипта, эти транскрипты будут захвачены на 50 различных микрогранул, каждая из которых содержит примерно 100 000 амплифицированных копий конкретной последовательности сигнатуры. Затем микрошарики помещают в проточную ячейку для секвенирования и количественного определения. Сигнатуры последовательностей расшифровываются путем параллельной идентификации четырех оснований путем гибридизации с флуоресцентно меченными кодерами (рис. 5). Каждый из кодировщиков имеет уникальную метку, которая обнаруживается после гибридизации путем получения изображения массива микрошариков. Следующим шагом является расщепление и удаление этого набора из четырех оснований и выявление следующих четырех оснований для нового раунда гибридизации с кодировщиками и получением изображений. Исходный результат представляет собой список сигнатурных последовательностей 17–20 п.н., которые могут быть аннотированы в геном человека для идентификации гена.
Чем длиннее последовательность тэгов дает более высокую специфичность, чем классическая SAGE тег 9-10 б.п.. Уровень экспрессии уникального гена представлен количеством транскриптов на миллион молекул, аналогично выходному сигналу SAGE. Существенным преимуществом является больший размер библиотеки по сравнению с SAGE. Библиотека MPSS обычно содержит 1 миллион тегов подписи, что примерно в 20 раз превышает размер библиотеки SAGE. Некоторые из недостатков, связанных с SAGE, также применимы к MPSS, такие как потеря определенных транскриптов из-за отсутствия сайта узнавания рестрикционного фермента и неоднозначность аннотации тегов. Высокая чувствительность и абсолютная экспрессия генов, безусловно, благоприятствуют MPSS. Однако эта технология доступна только через Lynxgen Therapeutics, Inc. (затем Solexa Inc до 2006 г., а затем - Illumina ).
