Войти
Мутагенез с насыщением последовательностей (SeSaM ) - это химио-ферментативный метод случайного мутагенеза, применяемый для направленной эволюции белки и ферменты. Это один из наиболее распространенных методов мутагенеза с насыщением. На четырех стадиях реакции на основе ПЦР, фосфоротиоат нуклеотиды вставляются в последовательность гена, расщепляются, и полученные фрагменты удлиняются универсальными или вырожденными нуклеотидами. Затем эти нуклеотиды заменяются стандартными нуклеотидами, что обеспечивает широкое распространение мутаций нуклеиновых кислот по последовательности гена с предпочтением трансверсий и с особым вниманием к последовательным точечным мутациям, которые трудно получить с помощью других методов мутагенеза. Методика была разработана профессором Ульрихом Шванебергом из Университета Якобса в Бремене и RWTH в Ахенском университете.
SeSaM был разработан для того, чтобы преодолеть несколько основных ограничений, возникающих при работе со стандартными методами мутагенеза, основанными на простых методах ПЦР, подверженных ошибкам (epPCR). Эти методы epPCR основаны на использовании полимераз и, таким образом, сталкиваются с ограничениями, которые в основном связаны с тем обстоятельством, что выполняются только одиночные, но очень редко последовательные замены нуклеиновых кислот, и что эти замены обычно происходят в определенных, предпочтительных положениях только. Кроме того, трансверсии нуклеиновых кислот гораздо менее вероятны, чем переходы, и требуют специально разработанных полимераз с измененным смещением. Эти характеристики обменов нуклеиновых кислот, катализируемых epPCR, вместе с тем фактом, что генетический код дегенерирован, уменьшают результирующее разнообразие на уровне аминокислот. Синонимичные замены приводят к сохранению аминокислот или консервативные мутации с аналогичными физико-химическими свойствами, такими как размер и гидрофобность, очень распространены. Путем неспецифического введения универсальных оснований в каждое положение в последовательности гена SeSaM преодолевает предвзятость полимеразы, благоприятствуя временным заменам в определенных положениях, но открывает полную последовательность гена для разнообразного набора аминокислотных замен.
Сравнение аминокислот паттерн замен, полученный с использованием стандартных методов epPCR (однонуклеотидные замены со смещением перехода) и метода мутагенеза с насыщением последовательности (введение последовательных нуклеотидных замен с увеличенным соотношением трансверсий). В ходе разработки SeSaM-метода было внесено несколько модификаций что позволило ввести сразу несколько мутаций. Еще одно усовершенствование метода было достигнуто за счет введения вырожденных оснований вместо универсального инозина и использования оптимизированных ДНК-полимераз, что дополнительно увеличивало соотношение введенных трансверсий. Этот модифицированный метод SeSaM-TV +, кроме того, позволяет и способствует введению двух последовательных замен нуклеотидов, сильно расширяя спектр аминокислот, которые могут быть заменены.
Посредством нескольких оптимизаций, включая применение улучшенной химера полимеразы на этапе III метода SeSaM-TV-II и добавление альтернативного вырожденного нуклеотида для эффективной замены оснований тимина и цитозина и увеличенная частота мутаций в SeSaM-P / R, созданные библиотеки были дополнительно улучшены в отношении числа трансверсий, и количество последовательных мутаций было увеличено до 2–4 последовательных мутаций со скоростью последовательных мутаций до 30%.
SeSaM-метод состоит из четырех этапов на основе ПЦР, которые могут быть выполнены в течение двух-трех дней. Основные части включают включение фосфоротиоатных нуклеотидов, химическую фрагментацию в этих положениях, введение универсальных или вырожденных оснований и их замену на точечные мутации вставки природных нуклеотидов.
Экспериментальные этапы создания библиотеки непредвзятого случайного мутагенеза с использованием метода мутагенеза с насыщением последовательностей. Первоначально универсальные последовательности «SeSaM» вставляются с помощью ПЦР со связыванием специфичных для гена праймеров перед и за геном представляет интерес. Представляющий интерес ген с его фланкирующими областями амплифицируется для введения этих последовательностей SeSaM_fwd и SeSaM_rev и для создания матрицы для последовательных этапов ПЦР.
Эти сгенерированные так называемые шаблоны fwd и rev теперь амплифицируются в реакции ПЦР с заранее определенной смесью фосфоротиоата и стандартных нуклеотидов, чтобы гарантировать равномерное распределение встроенных мутаций по всей длине гена. Продукты ПЦР стадии 1 специфически расщепляются по фосфоротиоатным связям, образуя пул одноцепочечных фрагментов ДНК разной длины, начиная с универсального праймера.
На этапе 2 SeSaM одиночные цепи ДНК удлиняются с помощью одного или нескольких универсальных или вырожденных оснований (в зависимости от применяемой модификации SeSaM), катализируемых концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT). Этот шаг является ключевым для введения характерных последовательных мутаций для случайного изменения целых кодонов.
Затем на этапе 3 выполняется ПЦР, рекомбинируя одноцепочечные фрагменты ДНК с соответствующей полноразмерной обратной матрицей, генерируя полноразмерный двухцепочечный ген, включающий универсальные или вырожденные основания в своей последовательности.
Путем замены универсальных / вырожденных оснований в последовательности гена случайными стандартными нуклеотидами на этапе 4 SeSaM генерируется разнообразный массив полноразмерных последовательностей генов с заменяющими мутациями, включая большое количество трансверсий и последующих замещения мутаций.
SeSaM используется для прямой оптимизации белков на аминокислотном уровне, а также для предварительной идентификации положений аминокислот для тестирования в мутагенезе насыщения для идеального обмена аминокислот. SeSaM успешно применялся в многочисленных целевых кампаниях по эволюции различных классов ферментов для их улучшения в сторону выбранных свойств, таких как целлюлаза для устойчивости к ионной жидкости, протеаза с повышенной толерантностью к детергентам, глюкозооксидаза для аналитического применения, фитаза с повышенной термостабильностью и монооксигеназа с улучшенным каталитическим действием эффективность использования альтернативных доноров электронов. SeSaM защищен патентом US770374 B2 в более чем 13 странах и является одной из технологий платформы SeSaM-Biotech GmbH.
