Анизотропия флуоресценции

Анизотропия флуоресценции или поляризация флуоресценции - это явление, при котором свет излучается флуорофором имеет неравные интенсивности по разным осям поляризации. Первыми пионерами в этой области были Александр Яблонски, Грегорио Вебер и Андреас Альбрехт. Принципы поляризации флуоресценции и некоторые применения этого метода представлены в книге Лаковича.

• 1 Определение анизотропии флуоресценции
• 2 Принцип - броуновское движение и фотоселляция
• 3 Приложения
• 4 См. Также
• 5 Ссылки

анизотропия (r) источника света определяется как отношение поляризованной составляющей к общей интенсивности ($IT\; \{\backslash \; displaystyle\; I\_\; \{T\}\}$):

$r\; =\; I\; z\; -\; I\; y\; I\; x\; +\; I\; y\; +\; I\; z\; \{\backslash \; displaystyle\; r\; =\; \{\backslash \; frac\; \{I\_\; \{z\}\; -I\_\; \{y\}\}\; \{I\_\; \{x\}\; +\; I\_\; \{y\}\; +\; I\_\; \{z\}\}\}\}$

Когда возбуждение поляризовано вдоль оси z, излучение флуорофора симметрично относительно оси z (рисунок). Следовательно, статистически мы имеем $I\; x\; =\; I\; y\; \{\backslash \; displaystyle\; I\_\; \{x\}\; =\; I\_\; \{y\}\}$. As $I\; y\; =\; I\; \perp \; \{\backslash \; displaystyle\; I\_\; \{y\}\; =\; I\; \_\; \{\backslash \; perp\}\}$и $I\; z\; =\; I\; \parallel \; \{\backslash \; displaystyle\; I\_\; \{z\}\; =\; I\; \_\; \{\backslash \; parallel\}\}$, мы имеем

$r\; =\; I\; \parallel \; -\; I\; \perp \; I\; \parallel \; +\; 2\; I\; \perp \; =\; Я\; \parallel \; -\; я\; \perp \; IT\; \{\backslash \; displaystyle\; r\; =\; \{\backslash \; frac\; \{I\; \_\; \{\backslash \; parallel\}\; -I\; \_\; \{\backslash \; per\; p\}\}\; \{I\; \_\; \{\backslash \; parallel\}\; +\; 2I\; \_\; \{\backslash \; perp\}\}\}\; =\; \{\backslash \; frac\; \{I\; \_\; \{\backslash \; parallel\}\; -I\; \_\; \{\backslash \; perp\}\}\; \{I\_\; \{T\}\}\}\}$.

броуновское движение наночастицы

При флуоресценции молекула поглощает фотон и возбуждается до состояния с более высокой энергией. После небольшой задержки (среднее значение, представленное как время жизни флуоресценции $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$), она переходит в более низкое состояние, теряя часть энергии в виде тепла и выделяя остальную часть энергия как другой фотон. Возбуждение и снятие возбуждения связаны с перераспределением электронов вокруг молекулы. Следовательно, возбуждение фотоном может происходить только в том случае, если электрическое поле света ориентировано по определенной оси вокруг молекулы. Кроме того, испускаемый фотон будет иметь определенную поляризацию по отношению к молекуле.

Первое понятие, которое необходимо понять для измерения анизотропии, - это концепция броуновского движения. Хотя вода при комнатной температуре, содержащаяся в стакане, для глаза может выглядеть очень неподвижно, на молекулярном уровне каждая молекула воды обладает кинетической энергией, и поэтому между молекулами воды происходит непрерывное количество столкновений. Наночастица (желтая точка на рисунке), подвешенная в растворе, будет совершать случайное блуждание из-за суммирования этих основных столкновений. Время корреляции вращения (Φ r), время, необходимое молекуле для поворота на 1 радиан, зависит от вязкости (η), температуры (T), постоянной Больцмана (k B) и объем (V) наночастицы:

$\varphi \; r\; =\; \eta \; V\; k\; BT\; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; phi\; \_\; \{r\}\; =\; \{\{\backslash \; eta\; V\}\; \backslash \; over\; \{k\; \{\_\; \{B\}\}\; T\}\; \}\}$

Вторая концепция - это фотоселляция с использованием поляризованного света. Когда поляризованный свет применяется к группе случайно ориентированных флуорофоров, большинство возбужденных молекул будут теми, которые ориентированы в определенном диапазоне углов к приложенной поляризации. Если они не перемещаются, излучаемый свет также будет поляризован в определенном диапазоне углов по отношению к приложенному свету.

Для однофотонного возбуждения собственная анизотропия r 0 имеет максимальное теоретическое значение 0,4, когда диполи возбуждения и излучения параллельны, и минимальное значение -0,2, когда диполи возбуждения и излучения перпендикулярны.

$r\; 0\; =\; 2\; 5\; (3\; cos\; 2\; \beta \; -\; 1\; 2)\; \{\backslash \; displaystyle\; \{r\_\; \{0\}\}\; =\; \{2\; \backslash \; over\; 5\}\; \backslash \; left\; (\{\{3\; \{\{\backslash \; cos\}\; ^\; \{2\}\}\; \backslash \; beta\; -1\}\; \backslash \; over\; 2\}\; \backslash \; right)\}$

где β - угол между диполями возбуждения и излучения. Для измерений стационарной флуоресценции ее обычно измеряют путем встраивания флуорофора в замороженный полиол.

В простейшем идеалистическом случае подмножество молекул красителя, взвешенных в растворе, которые имеют моноэкспоненциальное время жизни флуоресценции $\tau \; \{\; \backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$и r 0 = 0,4 (хорошим тестовым образцом является родамин 6 г в этиленгликоле с оптической плотностью ~ 0,05). Если возбуждение неполяризовано, то измеренное флуоресцентное излучение также должно быть неполяризованным. Однако если источник возбуждения вертикально поляризован с использованием поляризатора возбуждения, то эффекты поляризации будут обнаружены в измеренной флуоресценции. С этими поляризационными артефактами можно бороться, поместив поляризатор излучения под магическим углом 54,7º. Если эмиссионный поляризатор вертикально поляризован, произойдет дополнительная потеря флуоресценции, поскольку броуновское движение приводит к перемещению молекул красителя из исходной вертикально поляризованной конфигурации в неполяризованную конфигурацию. С другой стороны, если поляризатор излучения горизонтально поляризован, произойдет дополнительное введение возбужденных молекул, которые изначально были вертикально поляризованы и стали деполяризованными в результате броуновского движения. Сумма и разность флуоресценции могут быть построены путем сложения интенсивностей и вычитания интенсивностей флуоресценции соответственно:

$S\; =\; IVV\; +\; 2\; GIVH\; \{\backslash \; displaystyle\; S\; =\; \{I\_\; \{VV\}\}\; +\; 2G\; \{I\_\; \{VH\}\}\}$

$D\; =\; IVV\; -\; GIVH\; \{\backslash \; displaystyle\; D\; =\; \{I\_\; \{VV\}\}\; -\; G\; \{I\_\; \{VH\}\}\}$

Деление разницы на сумму дает уменьшение анизотропии:

$r\; =\; DS\; \{\backslash \; displaystyle\; r\; =\; \{D\; \backslash \; over\; S\}\}$

Фактор решетки G является инструментальным предпочтением эмиссионной оптики для горизонтальной ориентации по сравнению с вертикальной ориентацией. Его можно измерить, переместив поляризатор возбуждения в горизонтальную ориентацию и сравнив интенсивности, когда поляризатор излучения имеет вертикальную и горизонтальную поляризацию соответственно.

$G\; =\; I\; H\; H\; I\; H\; V\; \{\backslash \; displaystyle\; G\; =\; \{\{I\_\; \{HH\}\}\; \backslash \; over\; \{I\_\; \{HV\}\}\}\}$

G зависит от длины волны излучения. Примечание G в литературе определяется как показано обратное.

Степень декорреляции в поляризации падающего и излучаемого света зависит от того, как быстро ориентация флуорофора изменяется (время жизни вращения $\varphi \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; phi\}$) по сравнению на время жизни флуоресценции ($\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$). Перестановка ориентаций может происходить из-за переворачивания всей молекулы или вращения только флуоресцентной части. Скорость опрокидывания связана с измеренной анизотропией уравнением Перрина:

$r\; (\tau )\; =\; r\; 0\; 1\; +\; \tau \; /\; \tau \; c\; \{\backslash \; displaystyle\; r\; (\backslash \; tau)\; =\; \{\backslash \; frac\; \{r\_\; \{0\}\}\; \{\; 1+\; \backslash \; tau\; /\; \backslash \; tau\; \_\; \{c\}\}\}\}$

Где r - наблюдаемая анизотропия, r 0 - собственная анизотропия молекулы, $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$- время жизни флуоресценции, а $\tau \; c\; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\; \_\; \{c\}\}$- время корреляции вращения.

Этот анализ действителен, только если флуорофоры относительно далеко друг от друга. Если они очень близки друг к другу, они могут обмениваться энергией посредством FRET, и поскольку излучение может происходить от одной из многих независимо движущихся (или ориентированных) молекул, это приводит к более низкой, чем ожидалось, анизотропии или большей декорреляции. Этот тип гомотрансферной резонансной передачи энергии Фёрстера называется FRET миграции энергии или emFRET .

Стационарная анизотропия флуоресценции дает только «среднюю» анизотропию. Гораздо больше информации можно получить с помощью разнесенной по времени анизотропии флуоресценции, когда время затухания, остаточная анизотропия и время корреляции вращения можно определить путем подбора спада анизотропии. Обычно для возбуждения используется лазерный источник с вертикальными импульсами, а электроника синхронизации добавляется между стартовыми импульсами лазера (пуск) и измерением фотонов флуоресценции (стоп). Обычно используется метод коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов (TCSPC).

Опять же, используя простейший идеалистический случай, подмножество молекул красителя, взвешенных в растворе, которые имеют моноэкспоненциальное время жизни флуоресценции $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$и начальную анизотропию r 0 = 0,4. Если образец возбуждается импульсным вертикально ориентированным источником возбуждения, то следует измерить время одиночного затухания $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$, когда эмиссионный поляризатор находится под магическим углом. Если эмиссионный поляризатор имеет вертикальную поляризацию, вместо этого будут измеряться два времени затухания с положительными предэкспоненциальными факторами, первое время затухания должно быть эквивалентно $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$, измеренному с неполяризованным установка излучения и время второго затухания будут связаны с потерей флуоресценции, так как броуновское движение приводит к перемещению молекул красителя из исходной вертикальной поляризованной конфигурации в неполяризованную. С другой стороны, если эмиссионный поляризатор поляризован по горизонтали, два времени затухания снова будут восстановлены, первое с положительным предэкспоненциальным множителем и будет эквивалентно $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$но у второго будет отрицательный предэкспоненциальный множитель в результате введения возбужденных молекул, которые изначально были вертикально поляризованы и стали деполяризованными в результате броуновского движения. Сумма и разность флуоресценции могут быть построены путем сложения затуханий и вычитания затуханий флуоресценции соответственно:

$S\; (t)\; =\; GIVV\; (t)\; +\; 2\; IVH\; (t)\; \{\backslash \; displaystyle\; S\; (t)\; =\; G\; \{I\_\; \{VV\}\}\; (t)\; +2\; \{I\_\; \{VH\}\}\; (t)\}$

$D\; (t)\; =\; GIVV\; (t)\; -\; IVH\; (t)\; \{\backslash \; displaystyle\; D\; (t)\; =\; G\; \{I\_\; \{VV\}\; \}\; (t)\; -\; \{I\_\; \{VH\}\}\; (t)\}$

Деление разницы на сумму дает уменьшение анизотропии:

$r\; (t)\; =\; D\; (t)\; S\; (t)\; \{\backslash \; displaystyle\; r\; (\; t)\; =\; \{D\; (t)\; \backslash \; over\; S\; (t)\}\}$

В простейшем случае только для одного вида сферического красителя:

$r\; (t)\; =\; r\; 0\; exp\; \; (-\; t\; \varphi \; r)\; \{\; \backslash \; displaystyle\; r\; (t)\; =\; \{r\_\; \{0\}\}\; \backslash \; exp\; \backslash \; left\; (\{-\; \{t\; \backslash \; over\; \{\backslash \; phi\; \_\; \{r\}\}\}\}\; \backslash \; right)\}$

анизотропия флуоресценции может использоваться для измерения констант связывания и кинетики реакций, вызывающих изменение времени вращения молекул. Если флуорофор представляет собой небольшую молекулу, скорость его вращения может значительно снизиться, когда он связан с большим белком. Если флуорофор присоединен к большему белку в паре связывания, разница в поляризации между связанным и несвязанным состояниями будет меньше (потому что несвязанный белок уже будет достаточно стабильным и с самого начала будет медленно качаться), и измерение будет менее точным.. Степень связывания рассчитывается с использованием разницы в анизотропии частично связанного, свободного и полностью связанного (большой избыток белка) состояний, измеренной путем титрования двух партнеров связывания.

Если флуорофор связан с относительно большой молекулой, такой как белок или РНК, изменение подвижности, сопровождающее складывание, можно использовать для изучения динамики складывания. Это позволяет измерить динамику достижения белком своей окончательной стабильной трехмерной формы.

Анизотропия флуоресценции также применяется в микроскопии с использованием поляризаторов на пути освещающего света, а также перед камерой. Это может быть использовано для изучения локальной вязкости цитозоля или мембран, причем последние дают информацию о микроструктуре мембраны и относительных концентрациях различных липидов. Этот метод также использовался для обнаружения связывания молекул с их партнерами в сигнальных каскадах в ответ на определенные сигналы.

Явление emFRET и связанное с ним уменьшение анизотропии при близких взаимодействиях между флуорофорами было использовано для изучения агрегации белков в ответ на передачу сигналов.

• Коэффициенты трения Перрина
• Передача энергии FRET и BRET