Войти
Лабораторный разрушитель клеток Разрушение клеток - это метод или процесс высвобождения биологических молекул из внутри ячейки .
Производство биологически интересных молекул с использованием методов клонирования и культивирования позволяет изучать и производить соответствующие молекулы. За исключением выделяемых молекул, клетки, производящие интересующие молекулы, должны быть разрушены. На этой странице обсуждаются различные методы. Другой метод разрушения клеток называется снятие кровли ячейки.
В обычном механическом методе разрушения клеток в лабораторных масштабах используются стеклянные, керамические или стальные шарики диаметром от 0,1 до 2 мм, смешанные с образец суспендирован в водной среде. Впервые разработанная Тимом Хопкинсом в конце 1970-х годов смесь образца и гранул подвергается сильному перемешиванию путем перемешивания или встряхивания. Гранулы сталкиваются с клеточным образцом, открывая клетку и высвобождая межклеточные компоненты. В отличие от некоторых других методов, механический сдвиг умеренный во время гомогенизации, что приводит к превосходным мембранным или субклеточным препаратам. Этот метод, часто называемый «взбиванием», хорошо работает со всеми типами клеточного материала - от спор до тканей животных и растений. Это наиболее широко используемый метод лизиса дрожжей, который может давать ломкость более 50% (до 95%). Он имеет преимущество перед другими методами механического разрушения клеток, так как он может разрушать образцы очень небольшого размера, обрабатывать множество образцов за один раз, не опасаясь перекрестного загрязнения, и не выделяет потенциально вредные аэрозоли в процессе.
В простейшем примере метода равный объем гранул добавляют к суспензии клеток или тканей в пробирке, и образец энергично перемешивают на обычном лабораторном вихревом смесителе. Хотя время обработки невелико и занимает в 3-10 раз больше времени, чем в специальных встряхивающих машинах, он хорошо подходит для легко разрушаемых ячеек и стоит недорого.
Успешное взбивание шариков зависит не только от конструктивных особенностей устройства для встряхивания (которые учитывают колебания при встряхивании в минуту, выброс или расстояние при встряхивании, ориентацию при встряхивании и ориентацию флакона), но также и от выбора правильного размера шариков (0,1 –6 мм), состав шариков (стекло, керамика, сталь) и загрузка шариков во флаконе.
В большинстве лабораторий взбивание шариков производится партиями от одного до двадцати четырех запечатанных пластиковых флаконов или центрифужных пробирок. Образец и крошечные шарики перемешиваются со скоростью около 2000 колебаний в минуту в специально разработанных возвратно-поступательных шейкерах, приводимых в движение электродвигателями большой мощности. Разрушение клеток завершается через 1–3 минуты встряхивания. Значительно более высокие темпы разрушения клеток достигаются с помощью разновидности Beadbeater под названием SoniBeast. В отличие от обычных машин, он перемешивает шарики с помощью вихревого движения со скоростью 20000 об / мин. Более крупные машины для взбивания гранул, которые содержат планшеты для микротитрования с глубокими лунками, также сокращают время процесса, как и диспенсеры для гранул, предназначенные для быстрой загрузки гранул в несколько флаконов или микропланшетов. Также доступны предварительно загруженные флаконы и микропланшеты.
Все машины для взбивания шариков высокой энергии нагревают образец примерно на 10 градусов в минуту. Это происходит из-за фрикционных столкновений шариков во время гомогенизации. Охлаждение образца во время или после взбивания гранул может быть необходимо для предотвращения повреждения термочувствительных белков, таких как ферменты. Нагревание образца можно контролировать путем взбивания шариков в течение коротких интервалов времени с охлаждением на льду между каждым интервалом, путем обработки пробирок в предварительно охлажденных алюминиевых держателях для пробирок или путем циркуляции газообразного хладагента через устройство во время взбивания шариков.
В другой конфигурации взбивания шариков, подходящей для больших объемов образцов, используется вращающийся фторуглеродный ротор внутри камеры объемом 15, 50 или 200 мл для перемешивания шариков. В этой конфигурации камера может быть окружена статической охлаждающей рубашкой. Используя такую же конфигурацию ротора / камеры, доступны большие коммерческие машины для обработки многих литров клеточной суспензии. В настоящее время эти машины ограничены обработкой одноклеточных организмов, таких как дрожжи, водоросли и бактерии.
Образцы с твердым внеклеточным матриксом, такие как соединительная ткань животных, образцы биопсии некоторых опухолей, венозная ткань, хрящ, семена и т. Д., Измельчаются в мелкий порошок путем ударного измельчения при температурах жидкого азота. Этот метод, известный как криопульверизация, основан на том факте, что биологические образцы, содержащие значительную долю воды, становятся хрупкими при очень низких температурах. Этот метод был впервые описан Смакером и Пфистером в 1975 году, которые назвали его криоударом. Авторы продемонстрировали, что клетки эффективно разрушаются этим методом, подтверждая с помощью фазовой и электронной микроскопии, что плоскости разрушения пересекают клеточные стенки и цитоплазматические мембраны.
Этот метод может быть выполнен с использованием ступки и пестика, охлажденных до температур жидкого азота. но использование этого классического прибора трудоемко, и потеря образца часто вызывает беспокойство. Для этой цели также доступны специализированные измельчители из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей. Они требуют меньше ручных усилий, обеспечивают хорошее извлечение пробы и их легко чистить между пробами. Преимуществами этого метода являются более высокие выходы белков и нуклеиновых кислот из небольших образцов твердых тканей - особенно при использовании в качестве предварительного этапа к упомянутым выше методам механического или химического / химического разрушения клеток.
С 1940-х годов высокое давление использовалось в качестве метода разрушения ячейки, в первую очередь French Pressure Cell Press или French Press для короткая. Этот метод был разработан Чарльзом Стейси Френчем и использует высокое давление для проталкивания клеток через узкое отверстие, заставляя клетки лизироваться из-за сил сдвига, возникающих при перепаде давления. Хотя френч-прессы стали основным продуктом во многих микробиологических лабораториях, их производство было в значительной степени прекращено, что привело к возрождению альтернативных применений аналогичной технологии.
Современные физические разрушители ячеек обычно работают за счет пневматического или гидравлического давления. Хотя пневматические машины обычно имеют более низкую стоимость, их работа может быть ненадежной из-за колебаний рабочего давления на протяжении всего хода воздушного насоса. Обычно считается, что гидравлические машины обладают превосходной лизирующей способностью, особенно при обработке трудноразрушаемых образцов, таких как дрожжи или грамположительные бактерии, благодаря их способности поддерживать постоянное давление на протяжении всего хода поршня. Поскольку French Press, управляемый гидравлическим давлением, способен к лизису более 90% наиболее часто используемых типов клеток, он часто считается золотым стандартом в области лизиса, и современные машины часто сравнивают с ним не только с точки зрения лизиса. эффективность, но также с точки зрения безопасности и простоты использования. Некоторые производители также пытаются улучшить традиционную конструкцию, изменяя в этих машинах свойства, отличные от давления, при котором образец проходит через отверстие. Одним из таких примеров является компания Constant Systems, которая недавно продемонстрировала, что их разрушители клеток не только соответствуют характеристикам традиционного французского пресса, но и стремятся достичь тех же результатов при гораздо меньшей мощности.
Давление Cycling Technology («PCT»). PCT - это запатентованная технологическая платформа, которая использует чередующиеся циклы гидростатического давления между окружающим и сверхвысоким уровнями (до 90000 фунтов на квадратный дюйм) для безопасного, удобного и воспроизводимого контроля действий молекул в биологических образцах, например, разрыва (лизиса) клеток и тканей человека, животных, растений и микробов, а также инактивация патогенов. Системы с повышенным содержанием PCT (инструменты и расходные материалы) решают некоторые сложные проблемы, присущие подготовке биологических проб. Преимущества PCT включают: (а) экстракцию и восстановление большего количества мембранных белков, (б) улучшенное переваривание белков, (в) дифференциальный лизис в смешанной основе образца, (г) инактивацию патогенов, (д) повышенное обнаружение ДНК и (е) изысканный контроль процесса подготовки проб.
. Метод микрофлюидизатора, используемый для разрушения клеток, сильно влияет на физико-химические свойства лизированной клеточной суспензии, такие как размер частиц, вязкость, выход белка и активность ферментов. В последние годы метод микрофлюидизатора приобрел популярность при разрушении клеток из-за простоты использования и эффективности при разрушении множества различных типов клеток. Технология Microfluidizer была лицензирована компанией Arthur D. Little и была впервые разработана и использована в 1980-х годах, первоначально как инструмент для создания липосом. С тех пор он использовался в других приложениях, таких как разрушение клеток наноэмульсии и уменьшение размера твердых частиц, среди прочего.
За счет использования микроканалов с фиксированной геометрией и насоса-усилителя создаются высокие скорости сдвига, которые разрывают клетки. Этот метод лизиса клеток может привести к разрушению более 90% клеток E. coli.
Многие белки чрезвычайно чувствительны к температуре и во многих случаях могут начать денатурировать при температуре всего 4 градуса Цельсия. Внутри микроканалов температура превышает 4 градуса по Цельсию, но устройство спроектировано так, чтобы быстро охлаждаться, поэтому время воздействия на клетки повышенных температур чрезвычайно короткое (время пребывания 25-40 мс). Благодаря такому эффективному контролю температуры микрофлюидизатор обеспечивает более высокие уровни активных белков и ферментов, чем другие механические методы, когда белки чувствительны к температуре.
Также часто наблюдаются изменения вязкости при разрушении клеток. Если вязкость клеточной суспензии высока, это может затруднить последующую обработку, такую как фильтрация и точное пипетирование. Изменения вязкости, наблюдаемые при использовании микрофлюидизатора, относительно низкие и уменьшаются при дополнительных проходах через устройство.
В отличие от других методов механического разрушения, микрофлюидизатор разрушает клеточные мембраны эффективно, но мягко, что приводит к относительно большой клеточной стенке. фрагменты (450 нм), что облегчает разделение содержимого клеток. Это может привести к сокращению времени фильтрации и лучшему разделению при центрифугировании.
Технология микрофлюидизатора масштабируется от одного миллилитра до тысяч литров.
Для азотной декомпрессии большие количества азота сначала растворяются в ячейке под высоким давлением в подходящем сосуде высокого давления. Затем, когда давление газа внезапно снижается, азот выходит из раствора в виде расширяющихся пузырьков, которые растягивают мембраны каждой клетки, пока они не разорвутся и не выпустят содержимое клетки.
Азотная декомпрессия лучше защищает ферменты и органеллы, чем ультразвуковые и механические методы гомогенизации, и выгодно отличается от контролируемого разрушающего воздействия, полученного в Гомогенизатор с пестиком и PTFE, стеклянной ступкой. В то время как другие разрушающие методы зависят от трения или механического сдвига действия, которое генерирует тепло, процедура декомпрессии азота сопровождается адиабатическим расширением, которое охлаждает образец, а не нагревает его.
Покрытие из инертного газообразного азота, которое насыщает суспензию клеток и гомогенат, обеспечивает защиту от окисления компонентов клетки. Хотя в этом методе использовались другие газы: диоксид углерода, закись азота, оксид углерода и сжатый воздух, предпочтительным является азот, поскольку из-за его нереактивной природы и потому, что он не изменяет pH суспендирующей среды. Кроме того, предпочтительным является азот, поскольку он обычно доступен по низкой цене и при давлении, подходящем для этой процедуры.
После высвобождения субклеточные вещества не подвергаются постоянному истиранию, которое могло бы денатурировать образец или вызвать нежелательное повреждение. Нет необходимости следить за пиком между активностью фермента и процентом нарушения. Поскольку в каждой ячейке образуются пузырьки азота, одинаковая разрушающая сила применяется равномерно по всему образцу, обеспечивая таким образом необычную однородность продукта. Могут быть получены бесклеточные гомогенаты.
Метод используется для гомогенизации клеток и тканей, высвобождения интактных органелл, подготовки клеточных мембран, высвобождения лабильных биохимических веществ, и производить однородные и воспроизводимые гомогенаты, не подвергая образец экстремальным химическим или физическим нагрузкам.
Способ особенно хорошо подходит для лечения млекопитающих и других мембраносвязанных клеток. Его также успешно использовали для обработки растительных клеток, для высвобождения вируса из оплодотворенных яиц и для лечения хрупких бактерий. Не рекомендуется для необработанных бактериальных клеток. Дрожжи, грибок, споры и другие материалы с прочными клеточными стенками плохо реагируют на этот метод.
