Войти
Магнитное секвенирование - это разрабатываемый метод секвенирования одной молекулы . ДНК шпилька, содержащая интересующую последовательность, связана между магнитным шариком и стеклянной поверхностью. Магнитное поле применяется для растягивания шпильки на отдельные пряди, и шпилька повторно складывается после уменьшения магнитного поля. Длину шпильки можно определить путем прямого изображения дифракционных колец магнитных шариков с помощью простого микроскопа. Последовательности ДНК определяют путем измерения изменений длины шпильки после успешной гибридизации комплементарных нуклеотидов.
С разработкой различных платформ секвенирования следующего поколения произошло существенное снижение затрат и увеличение производительности секвенирования ДНК. Однако большинство технологий секвенирования основаны на клональной амплификации молекулы ДНК на основе ПЦР, чтобы довести сигнал до детектируемого диапазона. Секвенирование амплифицированных кластеров или массовое секвенирование в таком случае предлагают проблему фазирования, зависящую от длины чтения. Во время каждого цикла не все молекулы в основной массе успешно встраивают дополнительный нуклеотид. При увеличении цикла секвенирования сигнал отстающих молекул в конечном итоге превосходит истинный сигнал. Проблема фазирования является основным ограничением длины считывания в технологиях секвенирования следующего поколения. Следовательно, существует повышенный интерес к разработке технологий секвенирования отдельных молекул, где не требуется амплификация. Это не только сокращает время подготовки библиотек для секвенирования, но и дает возможность достичь гораздо большей длины чтения, поскольку отстающие молекулы с неудачными удлинениями можно игнорировать или рассматривать отдельно. Ранее известные технологии секвенирования одной молекулы включают секвенирование нанопор (Oxford Nanopore), секвенирование SMRT (Pacific Biosciences ) и секвенирование одной молекулы Heliscope (Helicos Биологические науки ).
шпилькой ДНК, прикрепленной к магнитной бусине и предметному стеклу 
Временная блокировка повторной укладки шпильки ДНК из-за событий гибридизации Интересующая молекула ДНК должна быть встроена в шпильку и прикреплена к магнитной бусине на одном конце и к неподвижной стеклянной поверхности на другом конце. Шпилька прикрепляется к поверхности стекла с помощью дигоксигенина -антидигоксигениновая связь. Магнитная бусина прикреплена к противоположному концу посредством взаимодействия биотин - стрептавидин. Такая установка шпильки ДНК может быть выполнена двумя способами:
Электромагниты помещается над предметным стеклом, а инвертированный микроскоп размещается ниже. Изображение снимается с помощью камеры CCD и передается в компьютер, где определяется трехмерное положение магнитных шариков. Положение шарика в горизонтальной плоскости предметного стекла, x и y, определяется путем корреляции изображений шариков в реальном времени. Вертикальная длина шпильки, измеренная по вертикальному положению прикрепленного магнитного шарика, измеряется диаметром дифракционного кольца шарика, который увеличивается с расстоянием.
Постоянная магнитная сила применяется для расстегивания шпильки ДНК, а уменьшение силы позволяет шпильке повторно застегиваться. Перед запуском последующих приложений выполняется несколько циклов разархивирования и повторного архивирования. Хотя сила магнитного поля, необходимая для распаковки и повторного сжатия, может варьироваться в зависимости от последовательности ДНК и длины шпильки, их абсолютные значения не критичны, если они согласованы в рамках цикла секвенирования.
Когда шпилька ДНК распаковывается до однонитевой, олигонуклеотиды, комплементарные последовательности шпильки, подвергаются гибридизации. Во время процесса повторного сжатия связанные олигонуклеотиды вызывают временные блокировки. Измерение длины шпильки во времени позволяет определить точное положение гибридизации, а также наличие несовпадений между олигонуклеотидом и шпилькой.
Этапы магнитного секвенирования с помощью гибридизации Гибридизация - это один из способов определения последовательности нити ДНК путем обнаружения изменений длины шпильки. Когда зонд гибридизируется с открытой шпилькой, полное повторное укладывание шпильки останавливается, и можно сделать вывод о положении гибридизированного зонда. Таким образом, последовательность интересующего фрагмента ДНК может быть выведена из перекрывающихся положений наборов зондов, которым разрешено гибридизоваться один за другим.
Во-первых, a Фрагмент ДНК может быть преобразован в новую последовательность, в которой каждый исходный нуклеотид кодируется определенной последовательностью из 8 нуклеотидов (A8, T8, G8 и C8), а затем лигирован со шпилькой.
После приложения магнитной силы в расстегнутом состоянии шпильки небольшое количество различающих нуклеотидов может гибридизоваться с новыми индивидуальными комплементарными последовательностями на шпильке, которая может временно блокировать повторную укладку шпильки.
Идентификацию положений блокировки шпильки, полученной в результате гибридизации распознающих нуклеотидов, можно наблюдать в виде пауз во времени измерения расстояния шпильки. Полную последовательность можно восстановить по перекрывающимся фрагментам.
Этапы магнитного секвенирования путем лигирования Другое применение магнитного секвенирования - использование шпильки от конца до конца для обнаружения последовательного лигирования олигонуклеотида. Первым шагом секвенирования путем лигирования является использование праймера для удлинения фрагмента ДНК. Сначала предпринимается попытка удлинения с помощью фрагмента, начинающегося с аденина, который может быть лигирован, только если следующий нуклеотид на противоположной цепи представляет собой тимин. Затем по очереди пробуются фрагменты, начинающиеся с цитозина, гуанина и тимина, и цикл повторяется. Магнитное поле высвобождается после каждого лигирования, а затем измеряется длина удлиненного праймера. После лигирования праймер удлиняется на семь оснований, что приводит к заметному увеличению расстояния шпильки до конца. После расщепления РНКазой в положении 2 следует лигирование для подготовки следующего цикла лигирования, так что следующее лигирование располагается непосредственно перед предыдущим.
7- Библиотека праймеров nt, 5'-NNNNNNrX-3 ', используется при лигировании короткого вырожденного олигонуклеотидного фрагмента, в котором N представляет любой из четырех дезоксирибонуклеотидов, а Nr представляет собой любой из четырех рибонуклеотидов., X - проверенная база (A, G, C, T). Проверяют лигирование с цепью праймера каждой из четырех тестируемых основ в циклах открытия и закрытия шпильки.
7-нуклеотидный праймер лигирует в открытом состоянии шпильки, что заблокировать сжатие последних семи нуклеотидов и увеличить расстояние между поверхностью и магнитным шариком на ~ 5 нм. Если перевязка не удалась, изменения длины шпильки не наблюдается.
РНКазой расщепление последних шести нуклеотидов является следующей стадией после лигирования, в конечном итоге удлиняющей цепь праймера на одно основание. Такое расщепление позволяет повторно сжать 6 нуклеотидов шпильки, о чем свидетельствует уменьшение длины шпильки на ~ 4 нм. Следовательно, на включение комплементарного нуклеотида указывает увеличение на 7 нуклеотидов (+5 нм) с последующим уменьшением на 6 нуклеотидов (-4 нм).
После РНКазы После расщепления последних шести нуклеотидов следующей стадией является фосфорилирование 5'-конца с помощью киназы. Затем можно повторить следующий цикл перевязки.
Многие из конкурирующих методов секвенирования одиночных молекул основаны на включении флуоресцентно меченых нуклеотидов. При секвенировании следующего поколения можно легко обнаружить сигнал флуоресценции кластеров. Однако, когда та же самая концепция применяется к секвенированию одной молекулы, наибольшие сложности возникают из-за высокого уровня ошибок. Поскольку трудно обнаружить отдельные меченые молекулы, эти платформы страдают от низкого отношения сигнал / шум, что часто приводит к неправильному обнаружению или не обнаружению флуоресцентных сигналов. В случае магнитного секвенирования измеряемым сигналом является изменение расстояния между двумя концами шпильки. Такой сигнал легко обнаружить стандартными камерами. Таким образом, сигналы легче обнаружить даже без использования дорогих устройств формирования изображения.
В дополнение к природе детектируемого сигнала другие реализации на этой платформе допускают еще более высокое отношение сигнал / шум. В случае магнитного секвенирования путем гибридизации используется набор перекрывающихся плиток, так что последовательность каждого нуклеотида определяется гибридизацией 8-мера. Таким образом, прибору требуется только чувствительность для обнаружения изменения на ~ 6 нм (длина 8 нуклеотидов). Аналогично, для секвенирования с помощью циклов лигирования успешное включение характеризуется увеличением на ~ 5 нм (лигирование 7-мера) с последующим уменьшением на ~ 4 нм (расщепление 6-мерной РНКазой) длины шпильки. В этом случае уменьшение длины на втором этапе является дополнительным подтверждением полученного сигнала.
При использовании текущих методов инструментальная погрешность в измеренной длине шпильки составляет 1-1,5 нм. Длина пары оснований или двух удлиненных одноцепочечных нуклеотидов составляет приблизительно 0,85 нм. Следовательно, разрешающая способность системы составляет несколько нуклеотидов. Источники шума возникают из-за зависящего от длины броуновского движения бусины, закрепленной удлиненной шпилькой, статистической ошибки в определении положения борта и медленных механических дрейфов. Однако, как упоминалось ранее, такого разрешения достаточно для текущего метода секвенирования, поскольку измеряются изменения>4 нм.
Посредством использования магнитных ловушек постоянная магнитная сила может быть приложена параллельно к миллионам закрепленных шпилькой магнитных шариков ДНК. Магнитную силу можно легко отрегулировать, изменив расстояние между ловушкой и магнитными шариками. Количество eads, которые можно одновременно контролировать, что определяет пропускную способность чтения этой платформы, ограничено размером шарика, длиной привязанной шпильки ДНК и пределом оптического разрешения. В настоящее время может быть достигнута плотность 750 К / мм (сопоставимая с Illumina HiSeq 2000).
Как упоминалось выше, шум из-за броуновских колебаний шарика увеличивается с длиной. Для определения максимальной длины чтения этой системы еще предстоит провести надежные тесты последовательности. Однако лигирование 7-мера в середине шпильки длиной 1241 нуклеотид было успешно обнаружено, что позволяет предположить, что существующей системы достаточно для секвенирования до ~ 500 п.н.
Скорость секвенирования или визуализации зависит от механической скорости движения магнитных шариков, которая ограничена силой сопротивления. В настоящее время можно измерить 10 циклов открытия-закрытия шпильки в секунду. Дополнительные осложнения включают наличие вторичной шпилечной структуры в интересующей ДНК. В таком случае петля ДНК, которая должна быть лигирована, должна быть сконструирована так, чтобы ее закрытие было предпочтительнее закрытия эндогенной петли в интересующей ДНК.
