Войти
Вектор клонирования pUC19, показывающий последовательность множественных сайтов клонирования с сайтами рестрикционных ферментов. Сайт множественного клонирования ( MCS ), также называемый полилинкером, короткий сегмент ДНК, который содержит множество (до \ 20) сайтов рестрикции - стандартная функция сконструированных плазмид. Сайты рестрикции в MCS обычно уникальны, они встречаются только один раз в данной плазмиде. Цель MCS в плазмиде - позволить фрагменту ДНК быть вставленным в эту область. MCS обнаруживается во множестве векторов, включая векторы клонирования для увеличения числа копий целевой ДНК и в векторах экспрессии для создания белкового продукта. В векторах экспрессии MCS располагается ниже промотора.
В некоторых случаях вектор может не содержать MCS. Скорее, к вектору можно добавить MCS. Первым шагом является создание комплементарных олигонуклеотидных последовательностей, которые содержат сайты рестрикционных ферментов вместе с дополнительными основаниями на конце, которые комплементарны вектору после переваривания. Затем олигонуклеотидные последовательности можно отжигать и лигировать в расщепленный и очищенный вектор. Расщепленный вектор разрезают рестрикционным ферментом, который дополняет выступающие части олигонуклеотидной вставки. После лигирования трансформируйте вектор в бактерии и проверьте вставку путем секвенирования. Этот метод также можно использовать для добавления новых сайтов ограничения к сайту множественного клонирования.
Диаграмма, показывающая процесс вставки сайта множественного клонирования в плазмидный вектор. Множественные сайты клонирования - это функция, которая позволяет вставлять чужеродную ДНК без нарушения остальной плазмиды, что делает ее чрезвычайно полезной в биотехнологии, биоинженерии и молекулярной генетике. MCS может помочь в создании трансгенных организмов, более известных как генетически модифицированный организм (ГМО), с использованием генной инженерии. Чтобы воспользоваться преимуществами MCS в генной инженерии, интересующий ген должен быть добавлен к вектору во время производства, когда MCS разрезана. После создания и лигирования MCS он будет включать интересующий ген и может быть амплифицирован для увеличения числа копий гена в бактерии-хозяине. После того, как бактерия реплицируется, интересующий ген может быть извлечен из бактерии. В некоторых случаях экспрессионный вектор можно использовать для создания белкового продукта. После того, как продукты изолированы, их можно использовать для самых разных целей, таких как производство инсулина, создание вакцин, производство антибиотиков и создание генной терапии.
Одна бактериальная плазмида, используемая в генной инженерии в качестве вектора клонирования плазмиды, - это pUC18. Его полилинкерная область состоит из нескольких сайтов узнавания рестрикционных ферментов, которые были сконструированы в единый кластер (полилинкер). Он имеет сайты рестрикции для различных ферментов рестрикции, включая EcoRI, BamHI и PstI. Другой вектор, используемый в генной инженерии, - это pUC19, который похож на pUC18, но его полилинкерная область инвертирована. E.coli также часто используется в качестве бактериального хозяина из-за доступности, быстрой скорости роста и универсальности.
Для того чтобы генетически сконструировать инсулин, первым делом необходимо разрезать MCS в используемой плазмиде. Как только MCS разрезан, можно добавить ген человеческого инсулина, сделав плазмиду генетически модифицированной. После этого генетически модифицированная плазмида помещается в бактериальный хозяин и дается возможность делиться. Чтобы обеспечить необходимый запас, клетки-хозяева помещают в большой резервуар для ферментации, который является оптимальной средой для хозяина. Процесс завершается отфильтровыванием инсулина от хозяина. Затем может происходить очистка, чтобы инсулин можно было упаковать и распределить среди людей с диабетом.
