Войти
Дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) - это хромосомы, полученные с помощью генной инженерии, полученные из ДНК дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, который затем лигируют с бактериальной плазмидой. Вставляя большие фрагменты ДНК, размером от 100 до 1000 т.п.н., вставленные последовательности можно клонировать и физически картировать с помощью процесса, называемого ходьбой по хромосомам. Это процесс, который первоначально использовался для проекта «Геном человека», однако из-за проблем со стабильностью от YAC отказались в пользу использования искусственных бактериальных хромосом (ВАС). Начиная с первоначального исследования Rankin et al., Strul et al. И Hsaio et al., Изначально хрупкая хромосома была стабилизирована путем обнаружения необходимой автономно реплицирующейся последовательности (ARS); усовершенствованный YAC, использующий эти данные, был описан в 1983 г. Murray et al. Основными компонентами YAC являются ARS, центромера и теломеры S. cerevisiae. Кроме того, для отбора трансформированных дрожжевых клеток используются гены селектируемых маркеров, таких как устойчивость к антибиотикам и видимый маркер. Без этих последовательностей хромосома не будет стабильной во время внеклеточной репликации и не будет отличаться от колоний без вектора.
Это фотография двух копий библиотеки YAC генома человека Вашингтонского университета. Каждая из стопок составляет примерно 12 микротитровальных планшетов. В каждом планшете 96 лунок, каждая с разными клонами дрожжей. YAC строится с использованием начальной кольцевой ДНК плазмиды, которую обычно разрезают на линейную молекулу ДНК с помощью рестрикционные ферменты ; ДНК-лигаза затем используется для лигирования представляющей интерес последовательности ДНК или гена в линеаризованную ДНК, образуя единый большой кольцевой фрагмент ДНК. Основное поколение линейных искусственных хромосом дрожжей можно разбить на 6 основных этапов:
1. Лигирование селектируемого маркера в плазмидный вектор: это позволяет проводить дифференциальный отбор колоний с маркером или без него. Ген устойчивости к антибиотикам позволяет амплифицировать вектор YAC и отбирать его для в E. coli за счет восстановления способности мутантной E.coli синтезировать лейцин в присутствии необходимых компонентов в среде для выращивания. Другими селектируемыми маркерами являются гены TRP1 и URA3. Сайт клонирования чужеродной ДНК вектора YAC расположен внутри гена SUP4. Этот ген компенсирует мутацию в дрожжевой клетке-хозяине, которая вызывает накопление красного пигмента. Клетки-хозяева обычно красные, а те , трансформированные только YAC, образуют бесцветные колонии. Клонирование чужеродного фрагмента ДНК в YAC вызывает инсерционную инактивацию гена, восстанавливая красный цвет. Следовательно, колонии, содержащие фрагмент чужеродной ДНК, имеют красный цвет.
2. Лигирование необходимых центромерных последовательностей для митотической стабильности
3. Лигирование автономно реплицирующихся последовательностей (ARS), обеспечивающее начало репликации для проведения митотической репликации. Это позволяет плазмиде реплицироваться вне хромосом, но делает плазмиду очень митотически нестабильной и легко теряется без центромерных последовательностей.
4. Лигирование искусственных теломерных последовательностей для преобразования кольцевой плазмиды в линейный фрагмент ДНК
5. Вставка последовательности ДНК для амплификации (до 1000кб)
6. Трансформационные дрожжевые колонии
В марте 2014 года Джеф Бёке из Медицинского центра Лангоне при Нью-Йоркском университете опубликовал, что его команда синтезировала один из С. cerevisiae 16 хромосом дрожжей, хромосома III, которую он назвал. Процедура включала замену генов в исходной хромосоме синтетическими версиями, а готовая синтезированная хромосома затем была интегрирована в дрожжевую клетку. Это потребовало разработки и создания 273 871 пары оснований ДНК - меньше, чем 316 667 пар в исходной хромосоме.
векторов экспрессии дрожжей, таких как YAC, YIps (интегрирующие плазмиды дрожжей) и YEps (эписомальные плазмиды дрожжей), имеют преимущество перед бактериальными искусственными хромосомами (ВАС) в том, что они могут использоваться для экспрессии эукариотических белков, требующих посттрансляционной модификации. Имея возможность вставлять большие фрагменты ДНК, YAC можно использовать для клонирования и сборки полных геномов организма. После встраивания YAC в дрожжевые клетки они могут быть размножены как линейные искусственные хромосомы, клонируя при этом встроенные участки ДНК. После этого можно использовать два процесса для получения секвенированного генома или интересующей области:
Это важно тем, что позволяет детально картировать определенные области генома. Были исследованы целые человеческие хромосомы, такие как Х-хромосома, определяющая местоположение генетических маркеров для многочисленных генетических нарушений и признаков.
Схема плазмиды pBR322, созданной Боливаром и Родригесом в 1972 году в лаборатории Бойера в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Это один из первых и наиболее широко используемых векторов и основа для YAC, созданных Мюрреем и Шостаком в 1983 году. Плазмида содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, а также набор сайтов-мишеней рестрикционных ферментов для вставки фрагментов ДНК. YAC значительно менее стабильны, чем BAC, вызывая «химерные эффекты»: артефакты, в которых последовательность клонированной ДНК фактически соответствует не одной области генома, а нескольким областям. Химеризм может быть вызван либо совместной лигированием нескольких геномных сегментов в один YAC, либо рекомбинацией двух или более YAC, трансформированных в одной и той же клетке дрожжей-хозяев. Заболеваемость химеризмом может достигать 50%. Другие артефакты - это удаление сегментов из клонированной области и перестройка геномных сегментов (например, инверсия). Во всех этих случаях последовательность, определенная на основе клона YAC, отличается от исходной естественной последовательности, что приводит к противоречивым результатам и ошибкам в интерпретации, если полагаться на информацию о клоне. Из-за этих проблем Проект генома человека в конечном итоге отказался от использования YAC и переключился на бактериальные искусственные хромосомы, где частота этих артефактов очень мала. Помимо проблем со стабильностью, в частности относительно частого возникновения химерных событий, YAC оказались неэффективными при создании минимального тайлинг-пути, охватывающего весь геном человека. Создание библиотек клонов занимает много времени. Кроме того, из-за характера зависимости от сайтов с тегами последовательностей (STS) в качестве ориентира при выборе подходящих клонов существуют большие пробелы, которые требуют дальнейшего создания библиотек для охвата. Именно это дополнительное препятствие побудило проект использовать вместо этого BAC. Это связано с двумя факторами:
1) BAC гораздо быстрее генерируются, и при создании избыточных библиотек клонов это важно
2) BAC обеспечивают более плотное покрытие с помощью STS, в результате в более полных и эффективных минимальных траекториях, созданных in silico.
Однако можно использовать оба подхода, как было продемонстрировано при изучении генома нематоды C. elegans. Там большая часть генома была покрыта BAC, а пробелы заполнены YAC.
