Войти
Пример системы T-REx, контролирующей экспрессию shRNA тетрациклина -Контролируемая активация транскрипции - это метод индуцибельной экспрессии гена, где транскрипция обратимо включается или выключается в присутствии антибиотика тетрациклина. или одно из его производных (например, доксициклин ).
Экспрессия гена, контролируемая тетрациклином, основана на механизме устойчивости к лечению тетрациклиновыми антибиотиками, обнаруженного у грамотрицательных бактерий. В природе P tet промотор экспрессирует TetR, репрессор, и TetA, протеин в том, что выкачивает тетрациклиновый антибиотик из клетки.
Разница между Tet-On и Tet-Off не в том, включает или выключает трансактиватор ген, как следует из названия; скорее, оба белка активируют экспрессию . Разница касается их соответствующей реакции на тетрациклин или доксициклин (Dox, более стабильный аналог тетрациклина); Tet-Off активирует экспрессию в отсутствие Dox, тогда как Tet-On активируется в присутствии Dox.
Названы две наиболее часто используемые системы индуцибельной экспрессии для исследования биологии клеток эукариот. Тет-офф и Тет-он. Система Tet-Off для контроля экспрессии представляющих интерес генов в клетках млекопитающих была разработана профессорами и в Гейдельбергском университете и впервые опубликована в 1992 году.
В системе Tet-Off используется белка-трансактиватора тетрациклина (tTA), который создается путем слияния одного белка, TetR (тетрациклиновый репрессор), обнаруженного в бактериях Escherichia coli, с доменом активации другого белка, VP16, обнаруженный в вирусе простого герпеса.
. Полученный в результате белок tTA способен связываться с ДНК в определенных последовательностях TetO operator. В большинстве систем Tet-Off несколько повторов таких последовательностей TetO располагаются перед последовательностью, такой как. Совокупность нескольких последовательностей TetO с минимальным промотором называется элементом ответа на тетрациклин (TRE), потому что он реагирует на связывание белка трансактиватора тетрациклина tTA повышенной экспрессией гена или генов ниже его промотора.
В системе Tet-Off экспрессия TRE-контролируемых генов может подавляться тетрациклином и его производными. Они связывают tTA и делают его неспособным связываться с последовательностями TRE, тем самым предотвращая трансактивацию TRE-контролируемых генов.
Система Tet-On работает аналогично, но в противоположном направлении. В то время как в системе Tet-Off tTA способен связывать оператора, только если он не связан с тетрациклином или одним из его производных, таким как доксициклин, в системе Tet-On белок rtTA способен связывать оператора, только если он связан тетрациклином. Таким образом, введение доксициклина в систему инициирует транскрипцию генетического продукта. Систему Tet-On иногда предпочитают Tet-Off из-за ее более быстрого реагирования.
Системы экспрессии Tet-Off также используются для получения трансгенных мышей, которые условно экспрессируют представляющий интерес ген.
Трансактиватор Tet-On Advanced (также известный как rtTA2-M2) представляет собой альтернативную версию Tet-On, которая демонстрирует пониженную базальную экспрессию и действует при концентрации Dox в 10 раз ниже, чем у Tet-Off. Кроме того, его экспрессия считается более стабильной в эукариотических клетках из-за того, что он оптимизирован по кодонам человека и использует 3 минимальных домена активации транскрипции. Он был открыт в 2000 году как один из двух улучшенных мутантов Х. Бухардом и его коллегами после случайного мутагенеза части Tet Repressor гена трансактиватора. Tet-On 3G (также известный как rtTA-V10) похож на Tet-On Advanced, но является производным от rtTA2-S2, а не от rtTA2-M2. Он также оптимизирован по кодонам человека и состоит из 3 минимальных доменов активации VP16. Однако белок Tet-On 3G имеет 5 аминокислотных отличий по сравнению с Tet-On Advanced, что, по-видимому, еще больше увеличивает его чувствительность к Dox. Tet-On 3G чувствителен к 100 раз меньше Dox и в 7 раз более активен, чем исходный Tet-On.
Другие системы, такие как система T-REx от Life Technologies работает иначе. Представляющий интерес ген фланкирован вышестоящим промотором CMV и двумя сайтами TetO2. Экспрессия интересующего гена подавляется высоким сродством связывания гомодимеров TetR с каждой последовательностью TetO2 в отсутствие тетрациклина. Введение тетрациклина приводит к связыванию одного тетрациклина с каждым гомодимером TetR с последующим высвобождением TetO2 гомодимерами TetR. Несвязывание гомодимеров TetR и TetO2 приводит к дерепрессии интересующего гена.
Модифицированная версия T-REx - это Linearizer синтетическая биологическая схема, оптимизированная для настройки экспрессии генов в эукариотических (почкующихся дрожжах, человеческих и т. Д.) Клетках. Путем включения сайтов TetO2 в промотор, управляющий экспрессией TetR, он создает отрицательную обратную связь, которая обеспечивает однородную экспрессию (низкий уровень шума) и линейную реакцию на дозу для аналогов тетрациклина.
В наиболее часто используемых плазмидах элемент ответа на тетрациклин состоит из 7 повторов бактериальной последовательности TetO длиной 19 п.н. (TCCCTATCAGTGATAGAGA), разделенных спейсерные последовательности (например: ACGATGTCGAGTTTAC). Именно TetO распознается и связывается частью TetR Tet-On или Tet-Off. TRE обычно размещается выше минимального промотора, который имеет очень низкую базальную экспрессию в отсутствие связанного Tet-Off (или Tet-On).
Система Tet имеет преимущества перед Cre, FRT и ER (рецептор эстрогена) условно системы экспрессии генов. В системах Cre и FRT активация или нокаут гена необратимы после завершения рекомбинации, тогда как в системах Tet и ER это обратимо. Система Tet очень жестко контролирует экспрессию, тогда как система ER несколько негерметична. Однако система Tet, которая зависит от транскрипции и последующей трансляции гена-мишени, не так быстро действует, как система ER, которая стабилизирует уже экспрессированный белок-мишень при введении гормона. Кроме того, поскольку последовательность tet-o длиной 19 п.о. в природе отсутствует в клетках млекопитающих, считается, что плейотропия минимизирована по сравнению с гормональными методами контроля. При использовании системы Tet в культуре клеток важно подтвердить, что каждая партия эмбриональной бычьей сыворотки тестируется, чтобы подтвердить, что контаминирующие тетрациклины отсутствуют или их слишком мало, чтобы препятствовать индуцибельности..
Механизм действия антибактериального эффекта тетрациклинов основан на нарушении трансляции белка в бактериях, тем самым нарушая способность микробов к росту и восстановлению; однако трансляция белка также нарушается в эукариотических митохондриях, что приводит к эффектам, которые могут искажать экспериментальные результаты.
