Войти
Дорожка 1 является отрицательным контролем и содержит только генетический материал. Дорожка 2 содержит белок, а также фрагмент ДНК, который, исходя из своей последовательности, не взаимодействует. Дорожка 3 содержит белок и фрагмент ДНК, который действительно реагирует; Полученный комплекс больше, тяжелее и медленнее. Образец, показанный на дорожке 3, является тем, который был бы результатом, если бы вся ДНК была связана и не происходило диссоциации комплекса во время электрофореза. Когда эти условия не выполняются, на дорожке 3 может быть видна вторая полоса, отражающая присутствие свободной ДНК или диссоциацию комплекса ДНК-белок. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) или электрофорез со сдвигом подвижности, также называемый анализ сдвига геля, анализ сдвига подвижности геля, анализ сдвига полосы или замедление геля анализ, представляет собой распространенный метод аффинного электрофореза, используемый для изучения взаимодействий белок-ДНК или белок - РНК. Эта процедура может определить, способен ли белок или смесь белков связываться с данной последовательностью ДНК или РНК, а иногда может указывать на то, участвует ли более одной белковой молекулы в связывающем комплексе. Анализы сдвига геля часто выполняются in vitro одновременно с следом ДНКазы, удлинением праймера и экспериментами с промотором-зондом при изучении инициации транскрипции, Репликация ДНК, репарация ДНК или обработка и созревание РНК, а также сплайсинг пре-мРНК. Хотя прекурсоры можно найти в более ранней литературе, большинство современных анализов основаны на методах, описанных Гарнером, Ревзином и Фридом и Кротерсом.
Анализ сдвига подвижности - это электрофоретическое разделение смеси белок-ДНК или белок-РНК на полиакриламиде или агарозный гель на короткий период (около 1,5-2 часов для геля размером 15-20 см). Скорость, с которой различные молекулы (и их комбинации) перемещаются через гель, определяется их размером и зарядом и, в меньшей степени, их формой (см. гель-электрофорез ). Контрольная дорожка (ДНК-зонд без белка) будет содержать единственную полосу, соответствующую несвязанному фрагменту ДНК или РНК. Однако, если предположить, что белок способен связываться с фрагментом, дорожка с белком, который связывается, будет содержать другую полосу, которая представляет более крупный, менее мобильный комплекс зонда нуклеиновой кислоты, связанный с белком, который «сдвинут» вверх на геле. (поскольку он двигался медленнее).
В правильных экспериментальных условиях взаимодействие между ДНК (или РНК) и белком стабилизируется, а соотношение связанных и несвязанных нуклеиновых кислот в геле отражает долю свободных и связанных молекул зонда как реакцию связывания. входит в гель. Эта стабильность частично обусловлена «эффектом клетки», заключающимся в том, что белок, окруженный гелевой матрицей, не может диффундировать от зонда до того, как они рекомбинируют. Если исходные концентрации белка и зонда известны, и если известна стехиометрия комплекса, можно определить кажущееся сродство белка к последовательности нуклеиновой кислоты. Если комплекс не является очень долгоживущим в условиях геля или не принимается во внимание диссоциация во время электрофореза, полученное число является кажущимся Kd. Если концентрация белка неизвестна, но известна сложная стехиометрия, концентрацию белка можно определить, увеличивая концентрацию ДНК-зонда до тех пор, пока дальнейшие приращения не увеличат долю связанного белка. По сравнению с набором стандартных разведений свободного зонда, проведенного на том же геле, можно рассчитать количество молей белка.
Антитело, распознающее белок, может быть добавлен к этой смеси, чтобы создать еще больший комплекс с большим сдвигом. Этот метод называется анализом сверхсдвига и используется для однозначной идентификации белка, присутствующего в комплексе белок-нуклеиновая кислота.
Часто дополнительную полосу проводят с конкурирующим олигонуклеотидом для определения наиболее подходящей связывающей последовательности для связывающего белка. Использование различных олигонуклеотидов с определенной последовательностью позволяет идентифицировать точный сайт связывания по конкуренции (не показано на диаграмме). Варианты конкурентного анализа полезны для измерения специфичности связывания и для измерения кинетики ассоциации и диссоциации. Таким образом, EMSA может также использоваться как часть эксперимента SELEX для отбора олигонуклеотидов, которые действительно связывают данный белок.
После определения связывания ДНК с белком in vitro ряд алгоритмов может сузить поиск идентификация фактора транскрипции. Олигонуклеотиды консенсусной последовательности для интересующего фактора транскрипции будут способны конкурировать за связывание, устраняя сдвинутую полосу, и должны быть подтверждены суперсдвигом. Если предсказанная консенсусная последовательность не может конкурировать за связывание, идентификации фактора транскрипции может помочь Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), посредством чего большие наборы консенсусных последовательностей мультиплексируются в каждой реакции, и когда один набор конкурирует за связывание, отдельные консенсусные последовательности из этого набора используются в следующей реакции.
Для целей визуализации фрагмент нуклеиновой кислоты обычно помечен радиоактивным, флуоресцентным или биотин этикетка. Стандартное окрашивание бромидом этидия менее чувствительно, чем эти методы, и может не обладать чувствительностью для обнаружения нуклеиновой кислоты, если в этих экспериментах используются небольшие количества нуклеиновой кислоты или одноцепочечной нуклеиновой кислоты (кислот). При использовании биотиновой метки стрептавидин, конъюгированный с ферментом, таким как пероксидаза хрена, используется для обнаружения фрагмента ДНК. Хотя изотопное мечение ДНК оказывает незначительное влияние или не влияет на аффинность связывания с белком, использование неизотопных меток, включая флурофоры или биотин, может изменять сродство и / или стехиометрию интересующего взаимодействия белков. Конкуренция между зондом, меченным флуорофором или биотином, и немеченой ДНК той же последовательности может использоваться для определения того, изменяет ли метка аффинность связывания или стехиометрию.
