Войти
Delitto perfetto (Итальянский: ) является генетический метод сайт-направленного мутагенеза in vivo в дрожжах. Это название по-итальянски означает «совершенное убийство», и оно относится к способности техники создавать желаемые генетические изменения, не оставляя чужеродной ДНК в геноме.
Этот метод был разработан группой в Национальном институте наук о гигиене окружающей среды (NIEHS), в состав которой входят Майкл А. Резник, Франческа Сторичи (сейчас на Технологический институт Джорджии) и Л. Кевин Льюис (ныне в Юго-Западном Техасском государственном университете). В методе используются синтетические олигонуклеотиды в сочетании с клеточным процессом гомологичной рекомбинации. Следовательно, он хорошо подходит для генетических манипуляций с дрожжами, которые имеют высокоэффективную гомологичную рекомбинацию. Подход delitto perfetto использовался для получения одиночных и множественных точечных мутаций, усечений или вставок генов и делеций целых генов (включая основные гены).
Основным преимуществом этого метода является его способность удалять любую чужеродную ДНК из генома после процесса мутагенеза. Это гарантирует, что в геноме не останется никаких выбираемых маркеров или экзогенных последовательностей, используемых для нацеливания, которые могут вызвать непредвиденные эффекты.
Техника delitto perfetto также проще по сравнению с другими методами сайт-направленного мутагенеза in vivo. Другие методы требуют нескольких этапов клонирования и обширного секвенирования ДНК для подтверждения мутагенеза, что часто является сложным и неэффективным процессом.
Этот подход отличается большой гибкостью, поскольку после вставки кассеты CORE ( подробности см. в Обзоре метода), можно легко и быстро произвести множественные мутации в интересующем гене.
Этот метод может быть применен к другим организмам, где эффективна гомологичная рекомбинация, таким как мох Physcomitrella patens, куриные клетки DT40 или E. coli. Кроме того, человеческие гены можно изучать и аналогичным образом генетически манипулировать в дрожжах с использованием искусственных хромосом дрожжей (YAC).
Поскольку метод delitto perfetto основан на гомологичной рекомбинации, этот процесс должен функционировать в клетках, чтобы метод работал. В Saccharomyces cerevisiae ген RAD52 необходим для гомологичной рекомбинации и, таким образом, необходим для метода delitto perfetto.
Метод полезен только для приложений, в которых выбираемые маркеры не нужны. Например, мутагенизированные штаммы дрожжей нельзя использовать для дальнейшего генетического анализа, такого как тетрадный анализ. Маркеры должны быть вставлены в соответствующий локус в отдельном процессе.
Delitto Perfetto - это двухэтапный метод мутагенеза in vivo. На начальном этапе кассета CORE вставляется в интересующую область путем гомологичной рекомбинации. Затем кассета CORE заменяется ДНК, содержащей интересующую мутацию.
Рисунок 1 . Кассеты CORE для Delitto Perfetto Кассета CORE содержит как невыбираемый маркер CO, так и ген портера RE . Репортерный ген позволяет отобрать дрожжевые клетки, которые получают кассету CORE на первом этапе процесса. Контрселективный маркер позволяет отбирать дрожжевые клетки, которые теряют кассету CORE, путем интеграции мутировавшего олигонуклеотида во время второй стадии процесса.
Существует множество кассет CORE на выбор, которые содержат множество репортерных генов, контрселектируемых производителей и дополнительные функции.
Рисунок 2 . Обзор Delitto Perfetto для удаления гена Сначала кассета CORE амплифицируется с помощью ПЦР с праймерами, содержащими области, гомологичные хромосомному сайту, в который она будет вставлена. Кассета CORE интегрируется посредством гомологичной рекомбинации. Клетки, содержащие кассету CORE, могут быть отобраны для использования репортерного гена и могут быть дополнительно подтверждены с использованием контрселективного маркера. Интеграция кассеты CORE в правильном хромосомном положении может быть проверена с помощью ПЦР с использованием праймеров, которые отжигаются выше сайта интеграции, внутри CORE и ниже размера интеграции, которые предназначены для генерации фрагментов размером 500-1500 п.н.
CORE-содержащие дрожжевые клетки трансформируются олигонуклеотидами, содержащими желаемую мутацию, так что они приводят к потере кассеты CORE во время гомологичной рекомбинации. Трансформанты отбираются с использованием контрселективного маркера и могут быть дополнительно подвергнуты скринингу с использованием репортерного гена. Секвенирование используется для гарантии того, что правильная мутация была произведена без дополнительных мутаций. В качестве альтернативы, если мутация приводит к образованию или потере сайта рестрикции, можно использовать ПЦР с последующим перевариванием рестрикции для подтверждения того, что желаемая мутация интегрирована.
Для увеличения нацеливания олигонуклеотидов на кассету CORE можно использовать кассеты CORE, содержащие свойство GAL1-I-SceI. Эта особенность позволяет экспрессировать SceI, эндонуклеазу, которая распознает уникальную 18-нуклеотидную последовательность, которая вряд ли встретится где-либо еще в геноме S. cerevisiae. Эндонуклеаза SceI способна генерировать DSB на сайте SceI, что приводит к привлечению механизма репарации ДНК. Это увеличивает частоту целевой гомологичной рекомбинации в 4000 раз по сравнению с тем случаем, когда DSB не генерируется.
Олигонуклеотиды размером 80–100 п.н. могут генерироваться в виде отдельных молекул или пар олигонуклеотидов, которые полностью или частично перекрываются. Тип рекомендованного олигонуклеотида зависит от типа мутации и расстояния от сайта интеграции кассеты CORE, на котором желательна мутация.
Более длинные олигонуклеотиды приводят к повышению эффективности трансформации. Полностью комплементарные пары олигонуклеотидов приводят к 5–10-кратному увеличению эффективности по сравнению с отдельными олигонуклеотидами и рекомендуются для всех применений. Однако они обеспечивают небольшое окно мутагенеза всего в 20-40 оснований из кассеты CORE. Чтобы увеличить окно мутагенеза, можно использовать пары олигонуклеотидов с перекрытием в 20 п.н., что позволяет нацеливать до 100 п.н. выше и ниже сайта интеграции CORE. Однако они трансформируются примерно в 6 раз менее эффективно. Для повышения эффективности частично перекрывающиеся олигонуклеотиды могут быть удлинены in vitro.
Разработаны олигонуклеотиды, содержащие последовательность, расположенную выше по течению, за которой следует последовательность ниже по течению от области, которая должна быть нокаутирована. Для делеций генов пары полностью перекрывающихся олигонуклеотидов размером 80–100 п.н. приводят к 5-10-кратному увеличению эффективности трансформации, чем одиночные олигонуклеотиды.
Для мутаций от 20 до 40 п.н. Рекомендуется кассета CORE, 80–100 п.н. полностью перекрывающиеся олигонуклеотиды. Для мутаций более 40 п.н. из кассеты CORE необходимо использовать частично перекрывающиеся олигонуклеотиды. Для повышения эффективности их трансформации рекомендуется удлинить частично перекрывающиеся олигонуклеотиды in vitro.
Для создания мутантов основных генов кассета CORE может быть вставлена ниже гена. представляет интерес, однако это ограничивает области гена, доступные для мутации. В качестве альтернативы можно использовать диплоидные клетки. Однако использование диплоида снижает эффективность нацеливания олигонуклеотидов из-за присутствия двух подходящих хромосомных участков для рекомбинации олигонуклеотидов. Чтобы устранить этот недостаток, можно использовать метод delitto perfetto, опосредованный DSB. Это увеличивает частоту целевой гомологичной рекомбинации в 700 раз по сравнению с тем, когда DSB не генерируется. Более того, он в 2–5 раз более эффективен, чем другие доступные методы.
Сообщается, что при отсутствии двухцепочечных разрывов количество клеток, теряющих CORE кассета в отсутствие нацеливающего олигонуклеотида составляет менее одного трансформанта на 10 жизнеспособных клеток. Напротив, это число увеличивается до 100 трансформантов на 10 жизнеспособных клеток, когда образуется двухцепочечный разрыв. В диплоиде повышенная частота фоновых мутаций происходит из-за гомологичной рекомбинации с гомологичной хромосомой, что снижает количество целевых трансформаций только до 4% от общего числа трансформантов.
