Войти
Нормализация данных Вестерн-блот - это аналитический шаг, который выполняли для сравнения относительного содержания определенного белка на полосах блоттинга или геля при различных экспериментальных обработках или в тканях или на стадиях развития. Общая цель нормализации - минимизировать эффекты, возникающие из-за вариаций экспериментальных ошибок, таких как непоследовательная подготовка образца, неравномерная загрузка образца по полосам геля или неравномерный перенос белка, что может поставить под угрозу выводы, которые могут быть получены с помощью Вестерн-блоттинга данные. В настоящее время существует два метода нормализации данных вестерн-блоттинга : (i) нормализация домашнего белка и (ii) нормализация общего белка.
Нормализация происходит непосредственно либо на геле, либо на блоттинговой мембране. Сначала визуализируется окрашенный гель или блот, обводится прямоугольник вокруг целевого белка на каждой дорожке и измеряется интенсивность сигнала внутри прямоугольника. Затем полученная интенсивность сигнала может быть нормализована относительно интенсивности сигнала внутреннего контроля загрузки, обнаруженного на том же геле или блоте. При использовании белковых красителей мембрану можно инкубировать с выбранным красителем до или после иммунодетекции, в зависимости от типа окраски.
Гены домашнего хозяйства и белки, включая β-Актин, GAPDH, HPRT1 и RPLP1 часто используются в качестве внутреннего контроля в вестерн-блотах, потому что они Считается, что они выражаются конститутивно на одних и тех же уровнях в разных экспериментах. Однако недавние исследования показали, что экспрессия белков домашнего хозяйства (HKP) может изменяться в зависимости от типа клеток и биологических условий. Поэтому научные издатели и финансирующие агентства теперь требуют, чтобы средства нормализации были предварительно проверены для каждого эксперимента, чтобы гарантировать воспроизводимость и точность результатов.
При использовании флуоресцентных антител для изображения белков в западных странах блотов, нормализация требует, чтобы пользователь определил верхний и нижний пределы количественного определения и охарактеризовал линейную зависимость между интенсивностью сигнала и массовым объемом образца для каждого антигена. И целевой белок, и нормализационный контроль должны флуоресцировать в динамическом диапазоне обнаружения. Многие HKP экспрессируются на высоких уровнях и предпочтительны для использования с высокоэкспрессируемыми белками-мишенями. Белки с низкой экспрессией трудно обнаружить на одном и том же блоте.
Флуоресцентные антитела коммерчески доступны, и для обеспечения согласованности результатов рекомендуются полностью охарактеризованные антитела.
Если флуоресцентное обнаружение не используется, белок, контролирующий загрузку, и интересующий белок должны значительно различаться по молекулярной массе, поэтому они должны быть адекватно разделены гель-электрофорезом для точного анализа.
Мембраны должны быть зачистка и повторное зондирование с использованием нового набора антител для обнаружения при обнаружении нескольких белковых мишеней на одном блоте. Неэффективное удаление может привести к слабому сигналу от целевого белка. Чтобы предотвратить потерю антигена, рекомендуется проводить только три инкубации со стриппингом на мембрану. Может быть трудно полностью исключить сигнал от белков с высоким содержанием белка, поэтому рекомендуется сначала обнаруживать белки с низкой экспрессией.
Поскольку уровни HKP могут быть непостоянными между тканями ученые могут контролировать интересующий белок, добавляя чистый экзогенный белок известной концентрации в линейном диапазоне антитела. По сравнению с HKP, для контрольных добавок доступно более широкий спектр белков.
При нормализации общего белка (TPN) содержание целевого белка нормализуется до общее количество белка на каждой дорожке. Поскольку TPN не зависит от одного элемента управления загрузкой, проверка элементов управления и снятие / повторное зондирование блотов для обнаружения HKP не требуется. Это может улучшить точность (до 0,1 мкг общего белка на дорожку), рентабельность и надежность данных.
Флуоресцентные пятна и гели без пятен требуют специального оборудования для визуализации белков на геле / блоте. Пятна могут не покрывать пятно равномерно; К краям пятна может скапливаться больше пятен, чем в центре. Неоднородность изображения может привести к неточной нормализации.
Анионные красители, такие как Ponceau S и Coomassie Brilliant Blue, и флуоресцентные красители, такие как Sypro Ruby и Deep Purple, используются перед добавлением антител, потому что они не влияют на последующую иммунообнаружение.
Ponceau S - это отрицательно заряженный обратимый краситель, который окрашивает белки в красновато-розовый цвет и легко удаляется промыванием в воде. Интенсивность окрашивания Ponceau S быстро уменьшается со временем, поэтому документацию следует проводить быстро. Сообщается о линейном диапазоне до 140 мкг для Ponceau S с плохой воспроизводимостью из-за его сильно зависящей от времени интенсивности окрашивания и низкого отношения сигнал / шум.
Флуоресцентные красители, такие как Sypro Ruby, имеют широкий линейный диапазон и более чувствительны, чем анионные красители. Это стойкие светостойкие пятна, которые можно визуализировать с помощью стандартного трансиллюминатора ультрафиолетового или синего света или лазерного сканирования. Затем мембраны можно задокументировать на пленке или в цифровом виде с помощью камеры CCD камеры. Окрашивание Sypro Ruby blot требует много времени и, как правило, насыщает более 50 мкг белка на дорожку.
Черный амидо - это обычно используемый стойкий анионный краситель пост-антитела, который более чувствительна, чем Ponceau S. Это краситель применяется после иммунообнаружения.
В технологии отсутствия пятен для визуализации используется химия в геле. Эта химическая реакция не влияет на перенос белка или последующее связывание антител. Кроме того, он не включает этапы окрашивания / обесцвечивания, и интенсивность полос остается постоянной во времени.
Технология без окрашивания не может обнаруживать белки, которые не содержат остатков триптофана. Для обнаружения требуется минимум два триптофана. Линейный диапазон для нормализации без пятен составляет до 80 мкг белка на дорожку для 18-луночных гелей и до 100 мкг на дорожку для 12-луночных гелей среднего размера Criterion. Этот диапазон совместим с типичными загрузками белка при количественном вестерн-блоттинге и позволяет рассчитывать контроль загрузки в широком диапазоне загрузки белка. Недавно стал доступен более эффективный метод удаления пятен. При использовании большого количества белка технология очистки от пятен продемонстрировала больший успех, чем технология окрашивания.
