Войти
Двухцветная 3D микроскопия с суперразрешением с Her2 и Her3 в клетках рака груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 - LIMON (SPDM + SMI Vertico, пространственно-модулированное освещение (Vertico-SMI ) - самый быстрый световой микроскоп для 3D анальный Анализ полных ячеек в диапазоне нанометров. Он основан на двух технологиях, разработанных в 1996 году: SMI (пространственно-модулированное освещение) и SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия). Эффективное оптическое разрешение этого оптического наноскопа достигло примерно 5 нм в 2D и 40 нм в 3D, что значительно превосходит предел разрешения λ / 2 (около 200 нм для синего света), применяемый в стандартной микроскопии с использованием пропускания или отражения естественного света. (в отличие от структурированного освещения или флуоресценции ) в соответствии с пределом разрешения Аббе Этот предел (также известный как предел Рэлея ) имел был определен Эрнстом Аббе в 1873 году и определяет предел достижимого разрешения микроскопов с использованием обычных методов.
Микроскоп Vertico-SMI был разработан командой под руководством Кристофа Кремера, заслуженного из Гейдельбергского университета, и основан на комбинации светооптических методов локализационной микроскопии (SPDM, спектральная прецизионная дистанционная микроскопия) и структурированного освещения (SMI, пространственно-модулированное освещение).
С марта 2008 года многие стандартные флуоресцентные красители, такие как GFP и флуоресцентные красители Alexa, могут использоваться с этой так называемой микроскопией локализации SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для которой для создания наноизображений достаточно только одной длины волны лазера подходящей интенсивности.
SMI обозначает особый тип лазерного оптического освещения (пространственно-модулированное освещение), а Vertico отражает вертикальное расположение оси микроскопа, которое делает возможным анализ фиксированных клеток, но также и живых клеток с оптическим разрешением ниже 10 нанометров (1 нанометр = 1 нм = 1 × 10 м).
Особенностью этой технологии по сравнению с методами фокусировки, такими как 4Pi микроскопия, является широкое поле экспозиции, которое позволяет отображать целые клетки в наномасштабе. Такое 3D-экспонирование целой клетки с типичным размером объекта 20 мкм × 20 мкм требует всего 2 минут. Экспозиция с широким полем означает, что весь объект освещается и обнаруживается одновременно.
SMI + TIRF ткани человеческого глаза, пораженной дегенерацией желтого пятна SMI-микроскопия - это светооптический процесс так называемого функция разброса точек -инжиниринг. Это процессы, которые изменяют функцию рассеяния точки (PSF) микроскопа подходящим образом для увеличения оптического разрешения и максимальной точности измерений расстояния флуоресцентных объектов, которые небольшой по сравнению с длиной волны освещающего света, или для извлечения других структурных параметров в нанометровом диапазоне.
Микроскоп SMI, разрабатываемый в Физическом институте Кирхгофа при Гейдельбергском университете, достигает этого следующим образом: интенсивность освещения в пределах диапазона объекта не является однородной, в отличие от обычных широкопольных флуоресцентных микроскопов, но пространственно модулируется в точным способом за счет использования двух противоположных мешающих лазерных лучей вдоль оси. Принцип пространственно модулированного волнового поля был разработан в 1993 году Бейли и др. Подход микроскопии SMI, используемый в приложении Heidelberg, перемещает объект с высокой точностью шагами через волновое поле, или само волновое поле перемещается относительно объекта за счет фазового сдвига. Это приводит к улучшенному осевому размеру и разрешению по расстоянию.
SMI можно комбинировать с другими технологиями сверхвысокого разрешения, например, с 3D LIMON или LSI- TIRF как полное внутреннее отражение интерферометр с боковой структурой подсветки. Этот метод SMI позволил получить светооптические изображения распределения автофлуорофоров в срезах ткани глаза человека с непревзойденным ранее оптическим разрешением. Использование трех различных длин волн возбуждения (488, 568 и 647 нм) позволяет собирать спектральную информацию о сигнале автофлуоресценции. Это было использовано для тканей глаза человека, пораженных дегенерацией желтого пятна AMD.
микроскопия одиночной молекулы YFP со сверхвысоким разрешением / SPDMphymod Один крошечный источник света может быть обнаружено намного лучше, чем разрешение микроскопа: хотя свет будет давать размытое пятно, компьютерные алгоритмы могут использоваться для точного расчета центра размытого пятна с учетом функции рассеяния точки микроскопа, шумовых свойств детектора и так далее. Однако этот подход не работает, когда слишком много источников близко друг к другу: все источники размываются вместе.
SPDM (спектральная прецизионная дистанционная микроскопия) - это семейство методов в флуоресцентной микроскопии, которое позволяет обойти эту проблему, измеряя всего несколько источников одновременно, так что каждый источник оптически изолирован "от других (то есть отделенных более чем разрешением микроскопа, обычно ~ 200-250 нм). Затем можно использовать описанную выше технику (нахождение центра каждого размытого пятна).
Если молекулы имеют множество различных спектров (спектры поглощения и / или спектры испускания), то можно наблюдать за светом всего нескольких молекул одновременно с использованием соответствующих источников света и фильтров. Молекулы также можно различать более тонкими способами, основанными на других методах.
Структурное разрешение, достигаемое с помощью SPDM, может быть выражено в терминах наименьшего измеряемого расстояния между двумя в их пространственном положении, определенным точечной частицей с разными спектральными характеристиками («топологическое разрешение»). Моделирование показало, что при подходящих условиях, касающихся точности локализации, плотности частиц и т. Д., «Топологическое разрешение» соответствует «пространственной частоте », что в терминах классического определения эквивалентно значительно улучшенной оптической разрешающая способность.
SPDM - это локализационная микроскопия, которая обеспечивает эффективное оптическое разрешение в несколько раз лучше, чем обычная оптическая разрешение (примерно 200–250 нм), представленное полушириной основного максимума функции эффективного точечного изображения. Применяя подходящие лазерные оптические прецизионные процессы, положение и расстояния, значительно меньшие, чем полуширина функции рассеяния точки (обычно 200–250 нм), могут быть измерены с нанометровой точностью между целями с разными спектральными характеристиками. Важная область применения - исследование генома (изучение функциональной организации генома ). Еще одна важная область применения - исследование структуры мембран.
Одной из наиболее важных основ локализационной микроскопии в целом является первая экспериментальная работа по локализации флуоресцентных объектов в наномасштабе (3D) в 1996 году и теоретическое и экспериментальное доказательство точности локализации с использованием видимого света в диапазон 1 нм - основа для локализационной микроскопии лучше, чем 1/100 длины волны.
Двухцветная локализационная микроскопия SPDMphymod / микроскопия сверхвысокого разрешения с Слитые белки GFP и RFP Только в последние два года в наноскопических исследованиях использовались молекулы, которые излучают одну и ту же спектральную частоту света (но с разными спектральными характеристиками в зависимости от характеристик мигания), но которые можно включать и выключать с помощью света, что необходимо для спектральной точной дистанционной микроскопии. Комбинируя многие тысячи изображений одной и той же клетки, стало возможным использовать лазерные оптические прецизионные измерения для записи изображений локализации со значительно улучшенным оптическим разрешением. Применение этих новых процессов наноскопии до недавнего времени представлялось очень сложным, поскольку предполагалось, что только специально изготовленные молекулы можно включать и выключать подходящим образом с помощью света.
В марте 2008 года лаборатория Кристофа Кремера обнаружила, что это также возможно для многих стандартных флуоресцентных красителей, таких как GFP, красителей Alexa и молекул флуоресцеина, при условии наличия определенных фото- физические условия присутствуют. Используя эту так называемую технологию SPDMphymod (физически изменяемые флуорофоры), для создания наноизображений достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности. В отличие от других локализационных микроскопов, когда используются специальные фотопереключаемые / фотоактивируемые флуоресцентные молекулы, для которых необходимы две длины волны лазера.
Ген GFP был введен и экспрессирован во многих прокариотических и эукариотических клетках и получил Нобелевскую премию. в Химия 2008 была присуждена Мартину Чалфи, Осаму Шимомуре и Роджеру Й. Цзеню за открытие и разработку зеленый флуоресцентный белок. Открытие того, что эти стандартные флуоресцентные молекулы могут быть использованы, расширяет применимость метода SPMD к многочисленным областям исследований в биофизике, клеточной биологии и медицине.
уже стандартные флуоресцентные красители успешно используется с технологией SPDMphymod: GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 и флуоресцеин.
LIMON (световая микроскопическая наноразмерная микроскопия) была изобретена в 2001 году в Гейдельбергском университете и сочетает в себе локализационную микроскопию и пространственно-модулированное освещение с 3D-микроскопией сверхвысокого разрешения.
Трехмерные изображения с использованием Vertico-SMI стали возможными благодаря комбинации SMI и SPDM, при этом сначала применяется SMI, а затем процесс SPDM. Процесс SMI определяет центр частиц и их разброс в направлении оси микроскопа. Хотя центр частиц / молекул может быть определен с точностью до 1-2 нм, разброс вокруг этой точки можно определить вплоть до осевого диаметра прибл. 30-40 нм.
Затем с помощью SPDM определяется поперечное положение отдельных частиц / молекул, достигая точности в несколько нанометров. В настоящее время SPDM достигает 16 кадров / сек при эффективном разрешении 10 нм в 2D (плоскость объекта); приблизительно 2000 таких кадров комбинируются с данными SMI (время сбора данных около 10 секунд) для получения трехмерного изображения с наивысшим разрешением (эффективное оптическое разрешение 3D составляет около 40-50 нм). С более быстрой камерой можно ожидать еще более высоких скоростей (до нескольких сотен кадров / сек, в стадии разработки). Используя подходящие красители, возможно даже более высокое эффективное оптическое 3D разрешение
Комбинируя SPDMphymod с SMI (оба изобретены в лаборатории Кристофа Кремера в 1996 году), можно получить двухцветную трехмерную реконструкцию пространственного расположения Her2 / neu и Кластеры Her3 были достигнуты. Положение белковых кластеров во всех трех направлениях можно было определить с точностью около 25 нм.
Несмотря на ее использование в биомедицинских лабораториях, технологии сверхвысокого разрешения может служить важным инструментом в фармацевтических исследованиях. Они могут быть особенно полезны при идентификации и оценке целей. Например, биомолекулярные машины (БММ) представляют собой очень сложные наноструктуры, состоящие из нескольких больших молекул, которые отвечают за основные функции в клетках организма. В зависимости от своего функционального статуса они имеют определенную трехмерную структуру. Примерами биомолекулярных машин являются нуклеосомы, которые позволяют ДНК, носителю генетической информации длиной два метра, складываться в клетках тела всего на несколько миллионных долей миллиметра в диаметре. Следовательно, ДНК может служить центром информации и управления.
Используя LIMON 3D в сочетании с комплексной маркировкой LIMON, можно впервые сделать видимыми скрытые белки или нуклеиновые кислоты 3D-молекулярного комплекса так называемых биомолекулярных машин без разрушения комплекса. До сих пор проблема в большинстве случаев заключалась в том, что комплекс необходимо было разрушить для детального анализа отдельных макромолекул в нем. В качестве альтернативы, для визуализации трехмерной структуры таких комплексов использовались виртуальные компьютерные модели или дорогостоящие методы ядерного магнитного резонанса.
