Войти
Фосфатидилинозитол 3,5-бисфосфат (PtdIns (3,5) P2) является одним из семи фосфоинозитиды, обнаруженные в мембранах эукариотических клеток. В покоящихся клетках уровни PtdIns (3,5) P2, обычно определяемые с помощью HPLC, являются самыми низкими среди конститутивно присутствующих фосфоинозитидов. Они примерно в 3-5 раз ниже по сравнению с уровнями PtdIns3P и PtdIns5P (фосфатидилинозитол-5-фосфат ) и более чем в 100 раз ниже, чем уровни PtdIns4P в большом количестве (Фосфатидилинозитол-4-фосфат ) и PtdIns (4,5) P2. Впервые сообщалось, что PtdIns (3,5) P2 встречается в мышиных фибробластах и почкующихся дрожжах S. cerevisiae в 1997 г. У S. cerevisiae PtdIns (3,5) уровни P2 резко повышаются во время гиперосмотического шока. Ответ на гиперосмотическую нагрузку не сохраняется в большинстве протестированных клеток млекопитающих, за исключением дифференцированных адипоцитов 3T3L1.
Единственный известный в настоящее время путь развития PtdIns ( 3,5) Производство P2 осуществляется путем синтеза, катализируемого фосфоинозитидкиназой PIKfyve. Эксперименты по отслеживанию импульсов на фибробластах мышей показывают, что PtdIns (3,5) P2 возвращается в PtdIns3P вскоре после своего синтеза. В клетках млекопитающих PtdIns (3,5) P2 синтезируется и превращается в PtdIns3P с помощью уникального белкового комплекса, содержащего два фермента с противоположной активностью: фосфоинозитидкиназу PIKfyve и PtdIns, содержащий домен Sac1 (3, 5) P2 5-фосфатаза, Sac3 / Фиг.4. Два фермента не взаимодействуют напрямую. Скорее, они объединяются ассоциированным регулятором PIKfyve, называемым ArPIKfyve / VAC14, который формирует тройной регуляторный комплекс, известный как комплекс PAS (от первых букв PIKfyve / ArPIKfyve / Sac3). PIKfyve прикрепляет комплекс PAS к Rab5GTP / PtdIns3P-обогащенным эндосомным микродоменам через свой домен пальца FYVE, который избирательно связывает PtdIns3P. Существенная роль комплекса PAS в синтезе и обороте PtdIns (3,5) P2 подтверждается данными о siRNA-опосредованном сайленсинге белков и гетерологичной экспрессии компонентов комплекса PAS в различных типах клеток, а также данными о генетическом нокауте PAS сложные белки.
Дополнительный путь обмена PtdIns (3,5) P2 включает семейство миотубулярина фосфатаз. Миотубуларин 1 и MTMR2 дефосфорилируют положение 3 PtdIns (3,5) P2; следовательно, продуктом этого гидролиза является PtdIns5P, а не PtdIns3P. Белки комплекса PAS эволюционно законсервированы с ортологами, обнаруженными в S. cerevisae (т.е. белки Fab1p, Vac14p и Fig4p), а также у всех эукариот с секвенированными геномами. Следовательно, считается, что PtdIns (3,5) P2 присутствует у всех эукариот, где он регулирует сходные клеточные функции. Дрожжи Fab1p, Vac14p и Fig4p также образуют комплекс, называемый комплексом Fab1. Однако комплекс Fab1 содержит дополнительные белки, которые могут добавлять дополнительный слой регуляции PtdIns (3,5) P2 у дрожжей. Состав белковых комплексов, регулирующих уровни PtdIns (3,5) P2 у других видов, еще предстоит выяснить.
PtdIns (3,5) P2 регулирует эндосомные операции (деление и слияние), которые поддерживают эндомембранный гомеостаз и надлежащее функционирование путей переноса, исходящих из эндосом или пересекающих их. Снижение уровней PtdIns (3,5) P2 при нарушениях клеточного PIKfyve за счет гетерологичной экспрессии ферментативно неактивных точечных мутантов PIKfyve, подавление медикаментозного действия siRNA, фармакологическое ингибирование и нокаут PIKFYVE - все это вызывает образование множественных цитозольных вакуолей, которые со временем становятся больше. Важно отметить, что вакуолизация, вызванная дисфункцией PIKfyve и истощением PtdIns (3,5) P2, является обратимой и может быть избирательно устранена с помощью цитозольной микроинъекции PtdIns (3,5) P2, сверхэкспрессии PIKfyve или вымывания ингибитора PIKfyve YM201636. Активность Sac3 фосфатазы в комплексе PAS также играет важную роль в регуляции уровней PtdIns (3,5) P2 и поддержании эндомембранного гомеостаза. Таким образом, цитоплазматическая вакуолизация, индуцированная доминантно-отрицательным мутантом PIKfyveK1831E, подавляется при совместной экспрессии точечного мутанта, неактивного по фосфатазе Sac3, вместе с ArPIKfyve. Анализы восстановления in vitro слияния эндосом и образования / отделения (деления) мультивезикулярных тел (MVB) предполагают положительную роль PtdIns (3,5) P2 в делении MVB из созревающих ранних эндосом и отрицательную роль в слиянии эндосом. PtdIns (3,5) P2 участвует в зависимом от микротрубочек ретроградном транспорте от ранних / поздних эндосом к транс сети Гольджи.
Острая терапия инсулином увеличивает уровни PtdIns (3,5) P2 в адипоцитах 3T3L1, как в изолированных мембранах, так и в интактных клетках, что способствует влиянию инсулина на транслокацию поверхности клеток GLUT4 и транспорт глюкозы. Эти клетки также демонстрируют заметное увеличение PtdIns (3,5) P2 при гиперосмотическом шоке. Другие стимулы, включая митогенные сигналы, такие как IL-2 и УФ-свет в лимфоцитах, активация протеинкиназы C с помощью PMA в тромбоциты и EGF стимуляция клеток COS также увеличивает уровни PtdIns (3,5) P2.
PtdIns (3,5) P2 играет ключевую роль в росте и развитии, что подтверждается доимплантационной летальностью модели мышей с нокаутом PIKfyve. Тот факт, что гетерозиготные мыши PIKfyve якобы нормальны и доживают до позднего взросления только с ~ 60% уровней PtdIns (3,5) P2 дикого типа, предполагает, что PtdIns (3,5) P2 в норме может быть в избытке.
Нокаут ArPIKfyve / Vac14 или Sac3 / Fig4 у мышей приводит к снижению уровней PtdIns (3,5) P2 на 30-50% и вызывает аналогичную массивную центральную нейродегенерацию и периферическую нейропатию. Эти исследования предполагают, что снижение уровней PtdIns (3,5) P2 по еще не выявленному механизму опосредует гибель нейронов. Напротив, нокаут фосфатазы MTMR2, который также вызывает периферическую невропатию, сопровождается повышением PtdIns (3,5) P2. Таким образом, остается неясным, влияют ли и каким образом аномальные уровни PtdIns (3,5) P2 избирательно на функции периферических нейронов.
Фосфоинозитиды обычно рассматриваются как заякоренные в мембране сигналы, рекрутирующие специфические цитозольные эффекторные белки. До сих пор было предложено несколько белков в качестве потенциальных эффекторов PtdIns (3,5) P2. К сожалению, ожидания, что такие эффекторы будут эволюционно консервативными и будут иметь общий PtdIns (3,5) P2-связывающий мотив высокой аффинности, остаются нереализованными. Например, делеция Atg18p, белка, участвующего также в аутофагии у S. cerevisae, вызывает увеличение вакуолей и 10-кратное увеличение PtdIns (3,5) P2. Atg18p связывает PtdIns (3,5) P2 с высоким сродством и специфичностью. Однако, за исключением аутофагии, ортологи Atg18p млекопитающих не обладают сходными функциями. Два др. Дрожжевых белка (Ent3p и Ent5p), обнаруженные в предвакуолярных и эндосомных структурах, являются потенциальными эффекторами PtdIns (3,5) P2 при сортировке MVB. Они содержат фосфоинозитид-связывающий домен ENTH, и их делеция вызывает дефекты сортировки MVB, напоминающие те, о которых сообщалось для делеции Fab1p. Однако ни Ent3p, ни Ent5p не обладают предпочтительной и высокой аффинной специфичностью связывания с PtdIns (3,5) P2 in vitro. VPS24 млекопитающих (член семейства заряженных мультивезикулярных белков тела (CHMP)) является еще одним предполагаемым эффектором PtdIns (3,5) P2. Увы, измерения поверхностного плазмонного резонанса не подтверждают специфическое или высокоаффинное распознавание PtdIns (3,5) P2 как для VPS24 млекопитающих, так и для дрожжей. Человеческий трансмембранный катионный канал TRPML1 (генетическая инактивация которого вызывает лизосомную болезнь накопления) был недавно выдвинут как эффектор PtdIns (3,5) P2 на основании анализов связывания in vitro и его способности спасать фенотип вакуолизации в фибробластах из ArPIKfyve / Vac14 нокаутные мыши. Но делеция ортологичного белка у дрожжей не вызывает увеличения вакуолей, что ставит под сомнение эволюционное сохранение этого эффекторного механизма. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эти или раскрыть еще неизвестные эффекторы PtdIns (3,5) P2.
