Войти
градиента pH через мембрану с протонами, проходящими через переносчик, встроенный в мембрану. Внутриклеточный pH (pHi ) - это мера кислотности или основности (т.е. pH ) внутриклеточной жидкости. PHi играет решающую роль в мембранном транспорте и других внутриклеточных процессах. В среде с неподходящим pHi биологические клетки могут нарушать функцию. Следовательно, pHi строго регулируется, чтобы обеспечить правильную клеточную функцию, контролируемый рост клеток и нормальные клеточные процессы. Механизмы, регулирующие pHi, обычно рассматриваются как переносчики плазматической мембраны, из которых существуют два основных типа - зависимые и независимые от концентрации бикарбоната (HCO. 3). Физиологически нормальный внутриклеточный pH обычно составляет от 7,0 до 7,4, хотя между тканями существует различие (например, pHi скелетных мышц млекопитающих обычно составляет 6,8–7,1). Также существует различие pH в различных органеллах, который может варьироваться от 4,5 до 8,0. pHi может быть измерен несколькими способами.
Внутриклеточный pH обычно ниже, чем внеклеточный pH из-за более низких концентраций HCO 3. Повышение внеклеточного (например, сыворотки ) парциального давления двуокиси углерода (pCO 2 ) выше 45 мм рт.ст. приводит к образованию угольной кислоты, которая вызывает снижение pHi, поскольку диссоциирует :
Поскольку биологические клетки содержат жидкость, которая может действовать как буфер, pHi можно довольно хорошо поддерживать в определенном диапазоне. Клетки соответственно регулируют свой pHi при повышении кислотности или основности, обычно с помощью датчиков CO 2 или HCO 3, присутствующих в мембране клетки. Эти сенсоры могут позволять H + проходить через клеточную мембрану, соответственно, позволяя pHi быть взаимосвязанным с внеклеточным pH в этом отношении.
Основные внутриклеточные буферные системы включают те, которые включают белки или фосфаты. Поскольку белки имеют кислые и основные области, они могут служить как донорами, так и акцепторами протонов для поддержания относительно стабильного внутриклеточного pH. В случае фосфатного буфера значительные количества слабой кислоты и конъюгированного слабого основания (H 2PO4и HPO 4) могут соответственно принимать или отдавать протоны для сохранения внутриклеточного pH:
Приблизительные значения pH различных органелл внутри клетки. Уровень pH в конкретной органелле зависит от ее конкретной функции.
Например, лизосомы имеют относительно низкий pH, равный 4,5. Кроме того, методы флуоресцентной микроскопии показали, что фагоциты также имеют относительно низкий внутренний pH. Поскольку обе эти органеллы являются деградирующими органеллами, которые поглощают и расщепляют другие вещества, им требуется высокая внутренняя кислотность для успешного выполнения своей предполагаемой функции.
В отличие от относительно низкого pH внутри лизосом и фагоцитов, митохондриальный матрикс имеет внутренний pH около 8,0, что примерно на 0,9 единицы pH выше, чем у внутреннего межмембранного пространства. Поскольку окислительное фосфорилирование должно происходить внутри митохондрий, это несоответствие pH необходимо для создания градиента через мембрану. Этот мембранный потенциал, в конечном итоге, позволяет митохондриям генерировать большие количества АТФ.
Протоны перекачиваются из митохондриального матрикса в межмембранное пространство по мере прохождения цепи переноса электронов, снижая pH межмембранного пространства. Существует несколько распространенных способов измерения внутриклеточного pH (pHi), в том числе с помощью микроэлектрода, красителя, чувствительного к pH, или с помощью методов ядерного магнитного резонанса. Для измерения pH внутри органелл можно использовать метод, использующий pH-чувствительные зеленые флуоресцентные белки (GFP).
В целом, все три метода имеют свои преимущества и недостатки. Использование красителей, возможно, является самым простым и достаточно точным, в то время как ЯМР представляет собой проблему относительно менее точного. Кроме того, использование микроэлектрода может быть проблематичным в ситуациях, когда клетки слишком малы или целостность клеточной мембраны не должна нарушаться. GFP уникальны тем, что они обеспечивают неинвазивный способ определения pH внутри различных органелл, однако этот метод не является наиболее точным с количественной точки зрения способом определения pH.
Микроэлектродный метод измерения pHi состоит из помещения очень маленького электрода в цитозоль клетки, проделывая очень маленькое отверстие в плазматической мембране клетки. Поскольку микроэлектрод содержит жидкость с высокой концентрацией H + внутри по сравнению с внешней стороной электрода, возникает потенциал из-за несоответствия pH между внутренней и внешней частью электрода. По этой разнице напряжений и заранее определенному pH жидкости внутри электрода можно определить внутриклеточный pH (pHi) интересующей клетки.
Другой способ измерения внутриклеточного pH (pHi) - это использование красителей, чувствительных к pH и флуоресцирующих по-разному при различных значениях pH. Этот метод, использующий флуоресцентную спектроскопию, заключается в добавлении этого специального красителя в цитозоль клетки. Возбуждая краситель в клетке энергией света и измеряя длину волны света, испускаемого фотоном, когда он возвращается в свое естественное энергетическое состояние, можно определить тип присутствующего красителя и связать его с внутриклеточным pH данного
Помимо использования pH-чувствительных электродов и красителей для измерения pHi, для количественного определения pHi также может использоваться спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР, как правило, выявляет информацию о внутренней части клетки, помещая клетку в среду с сильным магнитным полем. На основании соотношения между концентрациями протонированных и депротонированных форм фосфатных соединений в данной клетке можно определить внутренний pH клетки. Кроме того, ЯМР также можно использовать для выявления присутствия внутриклеточного натрия, который также может предоставить информацию о pHi.
С помощью ЯМР-спектроскопии было определено, что лимфоциты поддерживают постоянный внутренний pH 7,17 ± 0,06, однако, как и во всех клетках, внутриклеточный pH изменяется в том же направлении, что и внеклеточный pH.
Для определения pH внутри органелл, pH-чувствительный GFP часто используются как часть неинвазивной и эффективной техники. Используя кДНК в качестве матрицы вместе с соответствующими праймерами, ген GFP может быть экспрессирован в цитозоле, а продуцируемые белки могут нацеливаться на определенные области внутри клетки, такие как митохондрии, аппарат Гольджи, цитоплазма и эндоплазматический ретикулум. Если в этих экспериментах используются определенные мутанты GFP, которые очень чувствительны к pH во внутриклеточной среде, относительная величина результирующей флуоресценции может показать приблизительный pH окружающей среды.
