Визуализирующая микроскопия на основе флуоресценции

Визуализирующая микроскопия на основе флуоресценции или FLIM представляет собой метод визуализации, основанный на различиях в скорости экспоненциального затухания флуорофора из образца. Его можно использовать в качестве метода визуализации в конфокальной микроскопии, микроскопии с двухфотонным возбуждением и многофотонной томографии.

Для создания изображения в FLIM используется время жизни (FLT) флуорофора, а не его интенсивность. Время жизни флуоресценции зависит от локальной микросреды флуорофора, что исключает любые ошибочные измерения интенсивности флуоресценции из-за изменения яркости источника света, интенсивности фонового света или ограниченного фотообесцвечивания. Этот метод также имеет то преимущество, что сводит к минимуму эффект рассеяния фотонов в толстых слоях образца. В зависимости от микросреды измерения срока службы использовались в качестве индикатора для pH, вязкости и концентрации химических веществ.

• 1 Время жизни флуоресценции
• 2 Измерение
  • 2.1 Импульсное освещение
    • 2.1.1 TCSPC
    • 2.1.2 Метод стробирования
  • 2.2 Фазовая модуляция
• 3 Анализ
• 4 Приложения
  • 4.1 FRET-визуализация
• 5 См. Также
• 6 Ссылки
• 7 Внешние ссылки

A флуорофор, который возбуждается фотон перейдет в основное состояние с определенной вероятностью, основанной на скорости распада через ряд различных (радиационных и / или безызлучательных) путей распада. Чтобы наблюдать флуоресценцию, одним из этих путей должно быть спонтанное излучение фотона. В описании ансамбля излучаемая флуоресценция со временем затухает в соответствии с

$I\; (t)\; =\; I\; 0\; e\; -\; t\; /\; \tau \; \{\backslash \; displaystyle\; I\; (t)\; =\; I\_\; \{0\}\; e\; ^\; \{\; -t\; /\; \backslash \; tau\}\}$

где

$1\; \tau \; =\; \sum \; ki\; \{\backslash \; displaystyle\; \{\backslash \; frac\; \{1\}\; \{\backslash \; tau\}\}\; =\; \backslash \; sum\; k\_\; \{i\}\}$.

В приведенном выше примере $t\; \{\backslash \; displaystyle\; t\}$- время, $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$- время жизни флуоресценции, $I\; 0\; \{\backslash \; displaystyle\; I\_\; \{0\}\}$- начальная флуоресценция при $t\; =\; 0\; \{\backslash \; displaystyle\; t\; =\; 0\}$и $ki\; \{\backslash \; displaystyle\; k\_\; \{i\}\}$- скорости для каждого пути распада, по крайней мере одна из которых должна быть скоростью затухания флуоресценции $kf\; \{\backslash \; displaystyle\; k\_\; \{f\}\}$. Что еще более важно, время жизни $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$не зависит от начальной интенсивности и испускаемого света. Это можно использовать для проведения измерений, не основанных на интенсивности, при химическом зондировании.

Визуализация времени жизни флуоресценции дает изображения с интенсивностью каждого пикселя, определяемой параметром $\tau \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\}$, который позволяет видеть контраст между материалами с разной скоростью затухания флуоресценции (даже если эти материалы флуоресцируют на одной и той же длине волны), а также создает изображения, которые показывают изменения в других путях затухания, например, в Визуализация FRET.

Импульсное освещение

Время жизни флуоресценции можно определить во временной области с помощью импульсного источника. Когда популяция флуорофоров возбуждается ультракоротким или дельта импульсом света, флуоресценция с временным разрешением будет затухать экспоненциально, как описано выше. Однако, если импульс возбуждения или отклик обнаружения широкие, измеренная флуоресценция d (t) не будет чисто экспоненциальной. Инструментальная функция отклика IRF (t) будет свернута или смешана с функцией затухания F (t).

$d\; (t)\; =\; IRF\; (t)\; \otimes \; F\; (t)\; \{\backslash \; displaystyle\; \{d\}\; (t)\; =\; \{IRF\}\; (t)\; \backslash \; otimes\; \{F\}\; (t)\}$

Инструментальный отклик источник, детектор и электронику можно измерить, обычно по рассеянному возбуждающему свету. Восстановление функции затухания (и соответствующего времени жизни) создает дополнительные проблемы, так как деление в частотной области имеет тенденцию производить высокий шум, когда знаменатель близок к нулю.

TCSPC

Коррелированный по времени подсчет одиночных фотонов (TCSPC ) обычно используется, поскольку он компенсирует изменения в интенсивности источника и амплитуде импульсов одиночных фотонов. Используя коммерческое оборудование TCSPC, можно записать кривую затухания флуоресценции с временным разрешением до 405 фс. Записанная гистограмма затухания флуоресценции подчиняется статистике Пуассона, которая учитывается при определении степени соответствия во время подгонки. Более конкретно, TCSPC регистрирует время, в которое отдельные фотоны обнаруживаются быстрым однофотонным детектором (обычно фотоумножителем (PMT ) или однофотонным лавинным фотодиодом (SPAD).)) относительно возбуждающего лазерного импульса. Записи повторяются для нескольких лазерных импульсов, и после достаточного количества записанных событий можно построить гистограмму количества событий по всем этим записанным временным точкам. Затем эту гистограмму можно подогнать к экспоненциальной функции, которая содержит интересующую экспоненциальную функцию уменьшения времени жизни, и, соответственно, можно извлечь параметр времени жизни. Многоканальные системы ФЭУ с 16–64 элементами имеются в продаже, тогда как недавно продемонстрированные системы однофотонных лавинных диодов CMOS (SPAD) -TCSPC FLIM могут предложить еще большее количество каналов обнаружения и дополнительные недорогие опции.

Метод стробирования

Импульсное возбуждение все еще используется в этом методе. Прежде чем импульс достигнет образца, часть света отражается дихроичным зеркалом и обнаруживается фотодиодом, который активирует генератор задержки, управляющий стробируемым оптическим усилителем (GOI), который находится перед детектором CCD. GOI позволяет обнаруживать только ту долю времени, когда он открыт после задержки. Таким образом, с помощью настраиваемого генератора задержки можно собирать излучение флуоресценции после нескольких времен задержки, охватывающих временной диапазон затухания флуоресценции образца. В последние годы на рынок вышли интегрированные усиленные ПЗС-камеры. Эти камеры состоят из усилителя изображения, ПЗС-матрицы и встроенного генератора задержки. Камеры ICCD с самым коротким временем стробирования до 200ps и шагом задержки 10ps позволяют использовать FLIM с субнаносекундным разрешением. В сочетании с эндоскопом этот метод используется для интраоперационной диагностики опухолей головного мозга.

Фазовая модуляция

Время жизни флуоресценции может быть определено в частотной области с помощью метода фазовой модуляции. В этом методе используется источник света, который является импульсным или модулируемым на высокой частоте (до 500 МГц), такой как светодиод, диодный лазер или источник непрерывной волны в сочетании с электрооптическим модулятором или акустооптический модулятор. Флуоресценция (а) демодулируется и (б) сдвигается по фазе; обе величины связаны с характерными временами затухания флуорофора. Кроме того, y-компоненты для синусоидальных волн возбуждения и флуоресценции будут модулироваться, и время жизни может быть определено из коэффициента модуляции этих y-компонентов. Следовательно, 2 значения срока службы могут быть определены методом фазовой модуляции. Время жизни определяется путем подбора этих экспериментальных параметров. Преимуществом FLIM на основе ФЭУ или камеры в частотной области является быстрое получение изображения в течение всего срока службы, что делает его пригодным для таких приложений, как исследование живых клеток.

Целью алгоритма анализа является для извлечения кривой чистого распада из измеренного распада и для оценки времени жизни (а). Последнее обычно достигается путем подбора одно- или многоэкспоненциальных функций. Для решения этой проблемы было разработано множество методов. Наиболее широко используемый метод - это итеративная повторная свертка по методу наименьших квадратов, основанная на минимизации взвешенной суммы остатков. В этом методе теоретические кривые экспоненциального затухания свертываются с функцией отклика прибора, которая измеряется отдельно, и наилучшее соответствие находится путем итеративного вычисления остатков для различных входных данных до тех пор, пока не будет найден минимум. Для набора наблюдений $d\; (ti)\; \{\backslash \; displaystyle\; d\; (\{\{t\}\; \_\; \{i\}\})\}$сигнала флуоресценции во временном интервале i оценка времени жизни выполняется с помощью минимизация:

$\chi \; 2\; =\; \sum \; я\; [di\; (ti)\; -\; d\; 0\; я\; (ti,\; a,\; \tau )]\; 2\; \{\backslash \; displaystyle\; \{\{\backslash \; chi\}\; ^\; \{2\}\}\; =\; \backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{i\; \}\; \{\{\backslash \; left\; [\{\{d\}\; \_\; \{i\}\}\; (\{\{t\}\; \_\; \{i\}\})\; -\; \{\{d\}\; \_\; \{0i\}\}\; (\{\{t\}\; \_\; \{i\}\},\; a,\; \backslash \; tau)\; \backslash \; right]\}\; ^\; \{2\}\}\}$

Помимо экспериментальных трудностей, включая функцию отклика прибора, зависящую от длины волны, математическая обработка итерационной задачи дек-свертки не является прямой и медленной, и вначале дни FLIM сделали его непрактичным для попиксельного анализа. Неподходящие методы привлекательны, потому что они предлагают очень быстрое решение для оценки срока службы. Одним из основных и простых методов в этой категории является метод быстрого определения срока службы (RLD). RLD вычисляет время жизни и их амплитуды напрямую, разделяя кривую затухания на две части равной ширины $\delta \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; delta\}$t. Анализ выполняется путем интегрирования кривой затухания через равные интервалы времени $\delta \; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; delta\}$t:

$D\; 0\; =\; \sum \; i\; =\; 1\; K\; /\; 2\; I\; i\; \delta \; t\; D\; 1\; Знак\; равно\; \sum \; я\; знак\; равно\; K\; /\; 2\; KI\; я\; \delta \; T\; \{\backslash \; displaystyle\; \{\backslash \; begin\; \{matrix\}\; \{\{D\}\; \_\; \{0\}\}\; =\; \backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{i\; =\; 1\}\; ^\; \{K\; /\; 2\}\; \{\{\{I\; \}\; \_\; \{i\}\}\; \backslash \; delta\; t\}\; \{\{D\}\; \_\; \{1\}\}\; =\; \backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{i\; =\; K\; /\; 2\}\; ^\; \{K\}\; \{\{\{I\}\; \_\; \{i\}\}\; \backslash \; delta\; t\; \}\; \backslash \backslash \backslash \; end\; \{matrix\}\}\}$

Ii - это записанный сигнал в i-м канале, а K - количество каналов. Срок службы можно оценить с помощью:

$\tau \; =\; \delta \; t\; /\; ln\; \; (D\; 0\; /\; D\; 1)\; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\; =\; \backslash \; delta\; t\; /\; \backslash \; ln\; (\{\{D\}\; \_\; \{0\}\}\; /\; \{\{D\; \}\; \_\; \{1\}\})\}$

Для многоэкспоненциальных распадов это уравнение дает среднее время жизни. Этот метод может быть расширен для анализа биэкспоненциальных распадов. Одним из основных недостатков этого метода является то, что он не может учесть эффект отклика прибора, и по этой причине при анализе следует игнорировать раннюю часть измеренных кривых затухания. Это означает, что часть сигнала отбрасывается и точность оценки коротких времен жизни снижается.

Одна из интересных особенностей теоремы о свертке состоит в том, что интеграл свертки является произведением множителей, составляющих интеграл. Есть несколько методов, которые работают в преобразованном пространстве, которые используют это свойство для восстановления чистой кривой затухания из измеренной кривой. Преобразование Лапласа и Фурье наряду с разложением Лагерра по Гауссу использовалось для оценки времени жизни в преобразованном пространстве. Эти подходы быстрее, чем методы, основанные на деконволюции, но страдают от проблем с усечением и выборкой. Более того, применение таких методов, как разложение Лагерра-Гаусса, математически сложно. В методах Фурье время жизни одной кривой экспоненциального спада определяется как:

$\tau \; =\; 1\; n\; \omega \; A\; n\; B\; n\; \{\backslash \; displaystyle\; \backslash \; tau\; =\; \{\backslash \; frac\; \{1\}\; \{n\; \backslash \; omega\}\}\; \{\backslash \; frac\; \{\{\; A\}\; \_\; \{n\}\}\; \{\{B\}\; \_\; \{n\}\}\}\}$

Где:

$A\; n\; =\; \sum \; td\; (t)\; sin\; \; (n\; \omega \; t)\; \sum \; t\; IRF\; (t)\; sin\; \; (\; n\; \omega \; t)\; =\; \omega \; \tau \; 1\; +\; \omega \; 2\; \tau \; 2,\; B\; n\; =\; \sum \; td\; (t)\; cos\; \; (n\; \omega \; t)\; \sum \; t\; IRF\; cos\; \; (n\; \omega \; t)\; =\; 1\; 1\; +\; n\; \omega \; 2\; \tau \; 2,\; \omega \; Знак\; равно\; 2\; \pi \; T\; \{\backslash \; displaystyle\; \{\backslash \; begin\; \{matrix\}\; \{\{A\}\; \_\; \{n\}\}\; =\; \{\backslash \; frac\; \{\backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{t\}\; \{d\; (t)\; \backslash \; sin\; (n\; \backslash \; omega\; t)\}\}\; \{\backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{t\}\; \{IRF\; (t)\; \backslash \; sin\; (n\; \backslash \; omega\; t)\}\}\}\; =\; \{\backslash \; frac\; \{\backslash \; omega\; \backslash \; tau\}\; \{1\; +\; \{\{\backslash \; omega\}\; ^\; \{2\}\}\; \{\{\; \backslash \; tau\}\; ^\; \{2\}\}\}\},\; \{\{B\}\; \_\; \{n\}\}\; =\; \{\backslash \; frac\; \{\backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{t\}\; \{d\; (t)\; \backslash \; cos\; (n\; \backslash \; omega\; t)\}\}\; \{\; \backslash \; sum\; \backslash \; limits\; \_\; \{t\}\; \{IRF\; \backslash \; cos\; (n\; \backslash \; omega\; t)\}\}\}\; =\; \{\backslash \; frac\; \{1\}\; \{1\; +\; n\; \{\{\backslash \; omega\}\; ^\; \{2\}\}\; \{\{\backslash \; tau\}\; ^\; \{2\; \}\}\}\},\; \backslash \; omega\; =\; \{\backslash \; frac\; \{2\; \backslash \; pi\}\; \{T\}\}\; \backslash \backslash \backslash \; end\; \{matrix\}\}\}$

и n - номер гармоники, а T - общий временной диапазон обнаружения.

FLIM в первую очередь использовался в биологии как метод обнаружения фотосенсибилизаторов в клетках и опухолях, а также FRET в тех случаях, когда это сложно. Этот метод был разработан в конце 1980-х - начале 1990-х годов (метод стробирования: Bugiel et al. 1989. König 1989, Phase Modulation: Lakowicz et al. 1992) до более широкого применения в конце 1990-х годов. В культуре клеток он был использован для изучения передачи сигналов и транспорта рецептора EGF. Временная область FLIM (tdFLIM) также использовалась для демонстрации взаимодействия обоих типов ядерных белков промежуточных филаментов ламинов A и B1 в различных гомополимерах ядерной оболочки, которые в дальнейшем взаимодействуют друг с другом в структурах более высокого порядка. Визуализация FLIM особенно полезна в нейронах, где рассеяние света тканью мозга проблематично для логометрической визуализации. В нейронах визуализация FLIM с использованием импульсного освещения была использована для изучения белков семейства Ras, CaMKII, Rac и Ran. FLIM использовался в клинической многофотонной томографии для обнаружения внутрикожных раковых клеток, а также фармацевтических и косметических соединений.

Совсем недавно FLIM также использовался для обнаружения флаванолов в растительных клетках

FRET-визуализация

Поскольку время жизни флуоресценции флуорофора зависит как от излучения (то есть флуоресценции) и безызлучательных (то есть тушение, FRET) процессов, передача энергии от молекулы донора к молекуле акцептора уменьшит время жизни донора. Таким образом, измерения FRET с использованием FLIM могут предоставить метод различения состояний / окружения флуорофора. В отличие от измерений FRET на основе интенсивности, измерения FRET на основе FLIM также нечувствительны к концентрации флуорофоров и, таким образом, могут отфильтровывать артефакты, вызванные изменениями концентрации и интенсивности излучения в образце.

• Фазорный подход к времени жизни флуоресценции и построению спектральных изображений

1. ^Накабаяси, Такакадзу; Ван, Хуэй-Пин; Киндзё, Масатака; Охта, Нобухиро (4 июня 2008 г.). «Применение визуализации продолжительности жизни флуоресценции зеленого флуоресцентного белка для измерения внутриклеточного pH». Фотохимические и фотобиологические науки. 7 (6): 668–670. DOI : 10.1039 / B800391B. ISSN 1474-9092.
2. ^Levitt, James A.; Куимова, Марина К.; Яхиоглу, Гохан; Чунг, Пей-Хуа; Зулинг, Клаус; Филлипс, Дэвид (9 июля 2009 г.). «Связанные с мембраной молекулярные роторы измеряют вязкость в живых клетках с помощью флуоресцентной визуализации времени жизни». Журнал физической химии C. 113 (27): 11634–11642. doi : 10.1021 / jp9013493. HDL : 10044/1/15590. ISSN 1932-7447.
3. ^Руэдас-Рама, Мария Дж.; Орте, Ангел; Холл, Элизабет А. Х.; Alvarez-Pez, Jose M.; Талавера, Ева М. (20 февраля 2012 г.). «Наносенсор хлорид-иона для флуориметрии с временным разрешением и визуализации времени жизни флуоресценции». Аналитик. 137 (6): 1500–1508. DOI : 10.1039 / C2AN15851E. ISSN 1364-5528.
4. ^Агронская, Александра В.; Tertoolen, L.; Герритсен, Ханс К. (ноябрь 2004 г.). «Быстрое получение изображения времени жизни флуоресценции кальция в живых клетках». Журнал биомедицинской оптики. 9 (6): 1230–1237. doi : 10.1117 / 1.1806472. ISSN 1083-3668.
5. ^Джозеф Р. Лакович. Принципы флуоресцентной спектроскопии 3-е издание. Спрингер (2006). ISBN 978-0387-31278-1.
6. ^«SPC-150NX, Описание продукта». Беккер и Хикл. Becker Hickl GmbH. 26 апреля 2017 г. Получено 26 апреля 2017 г.
7. ^«PML-16, Product description». Беккер и Хикл. Becker Hickl GmbH. 26 апреля 2017 г. Получено 26 апреля 2017 г.
8. ^Ли, Дай-Уэй; Арльт, Йохен; Ричардсон, Джастин; Уокер, Ричард; Но, Алекс; Стоппа, Дэвид; Шарбон, Эдоардо; Хендерсон, Роберт (2010). «Система визуализации времени жизни флуоресценции в реальном времени с матрицей однофотонных лавинных диодов CMOS 32 × 32 0,13 мкм с низким счетом темноты». Оптика Экспресс. 18 (10): 10257–69. Bibcode : 2010OExpr..1810257L. DOI : 10.1364 / OE.18.010257. PMID 20588879.
9. ^Чанг, CW; Sud, D; Мычек, Массачусетс (2007). Визуализирующая микроскопия на протяжении жизни флуоресценции. Методы клеточной биологии. 81 . С. 495–524. DOI : 10.1016 / S0091-679X (06) 81024-1. ISBN 9780123740250. PMID 17519182.
10. ^Elson, D. S.; Манро, I; Requejo-Isidro, J; Макгинти, Дж; Дансби, К; Галлетлы, N; Марка, G Вт; Нил, МА А; Рычаг, М Дж; Kellett, PA; Даймоук-Брэдшоу, А; Hares, J; Французский, P M W (2004). «Визуализация времени жизни флуоресценции во временной области в реальном времени, включая однократное получение с помощью сегментированного оптического усилителя изображения». Новый журнал физики. 6 (1): 180. Bibcode : 2004NJPh.... 6..180E. дой : 10.1088 / 1367-2630 / 6/1/180.
11. ^Сунь, Инхуа; Хатами, Ниса; Да, Мэтью; Марку, Дженнифер; Elson, Daniel S.; Горин, Фредрик; Schrot, Rudolph J.; Фиппс, Лаура (2010). «Визуализирующая микроскопия на протяжении жизни флуоресценции для хирургии под контролем изображения опухоли головного мозга» (PDF). Журнал биомедицинской оптики. 15 (5): 056022–056022–5. Bibcode : 2010JBO.... 15e6022S. doi : 10.1117 / 1.3486612. PMC 2966493. PMID 21054116.
12. ^Гаделла, T.W.J., редактор, методы FRET и FLIM. Elsevier, 2009 https://books.google.com/books/about/FRET_and_FLIM_Techniques.html?id=uHvqu4hLhH8Credir_esc=y
13. ^Oida, T.; Sako, Y; Кусуми, А (1993). «Визуализирующая микроскопия на протяжении жизни флуоресценции (флимскопия). Разработка и применение методологии для изучения слияния эндосом в отдельных клетках». Биофизический журнал. 64 (3): 676–85. Bibcode : 1993BpJ.... 64..676O. DOI : 10.1016 / S0006-3495 (93) 81427-9. PMC 1262380. PMID 8471720.
14. ^Lakowicz, Joseph R.; Шмацински, Хенрик; Новачик, Казимеж; Берндт, Клаус В.; Джонсон, Майкл (1992). «Визуализация времени жизни флуоресценции». Аналитическая биохимия. 202 (2): 316–30. DOI : 10.1016 / 0003-2697 (92) 90112-K. PMC 6986422. PMID 1519759.
15. ^Lakowicz, Joseph R.; Шмацински, H; Новачик, К; Джонсон, ML (1992). «Флуоресцентная визуализация свободного и связанного с белком НАДН». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 89 (4): 1271–5. Bibcode : 1992PNAS... 89.1271L. doi : 10.1073 / pnas.89.4.1271. PMC 48431. PMID 1741380.
16. ^Wouters, Fred S.; Bastiaens, Philippe I.H. (1999). «Визуализация времени жизни флуоресценции активности рецепторной тирозинкиназы в клетках». Текущая биология. 9 (19): 1127–30. DOI : 10.1016 / S0960-9822 (99) 80484-9. PMID 10531012.
17. ^Verveer, Peter J.; Wouters, FS; Рейнольдс, АР; Bastiaens, PI (2000). «Количественная визуализация латерального распространения сигнала рецептора ErbB1 в плазменной мембране». Наука. 290 (5496): 1567–70. Bibcode : 2000Sci... 290,1567V. doi : 10.1126 / science.290.5496.1567. PMID 11090353.
18. ^Дельбарре, Эрван; Трамайер, Марк; Коппи-Мойзан, Майте; Гайяр, Клэр; Курвалин, Жан-Клод; Буэндиа, Бриджит (2006). «Усеченный преламин A при синдроме прогерии Хатчинсона-Гилфорда изменяет сегрегацию гомополимеров ламината A-типа и B-типа» (PDF). Молекулярная генетика человека. 15 (7): 1113–1122. DOI : 10,1093 / hmg / ddl026. PMID 16481358.
19. ^Ясуда, Рёхей (2006). «Визуализация пространственно-временной динамики нейрональных сигналов с использованием флуоресцентного резонансного переноса энергии и микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции». Текущее мнение в нейробиологии. 16 (5): 551–61. doi : 10.1016 / j.conb.2006.08.012. PMID 16971112.
20. ^Харви, Кристофер Д.; Yasuda, R; Чжун, Н; Свобода, К (2008). «Распространение активности Ras, вызванное активацией одного дендритного отростка». Наука. 321 (5885): 136–40. Bibcode : 2008Sci... 321..136H. doi : 10.1126 / science.1159675. PMC 2745709. PMID 18556515.
21. ^Калаб, Петр; Содерхольм, Джон (2010). «Конструкция молекулярных сенсоров на основе Фёрстера (флуоресценция) с резонансным переносом энергии (FRET) для Ran GTPase». Методы. 51 (2): 220–32. doi : 10.1016 / j.ymeth.2010.01.022. PMC 2884063. PMID 20096786.
22. ^Мюллер-Харви, Ирэн; Фейхт, Вальтер; Польстер, Юрген; Трнкова, Люси; Бургос, Пьер; Паркер, Энтони У.; Ботчуэй, Стэнли У. (2012). «Двухфотонное возбуждение с изображением времени жизни пикосекундной флуоресценции для обнаружения ядерной ассоциации флаванолов». Analytica Chimica Acta. 719 : 68–75. doi : 10.1016 / j.aca.2011.12.068. PMID 22340533.
23. ^Беккер, Вольфганг; Бергманн, Аксель (2003). «Пожизненные методы визуализации для оптической микроскопии» (PDF). п. 4.

• Флуоресцентная визуализация в возбужденном состоянии
• Срок службы и инструменты спектрального анализа в ImageJ: http://spechron.com
• Флуоресцентная микроскопия для визуализации в течение всего срока службы
• Принцип TCSPC FLIM (Becker Hickl GmbH)