Войти
Символ реактора периодического действия с подпиткой Культура периодического действия с подпиткой в самом широком смысле определяется как рабочий метод в биотехнологических процессах, в которых одно или несколько питательных веществ ( субстратов) подаются (поставляются) в биореактор во время культивирования и в котором продукт (ы)) остаются в биореакторе до конца цикла. Альтернативным описанием метода является описание культуры, в которой «базовая среда поддерживает исходную культуру клеток, а питательная среда добавляется для предотвращения истощения питательных веществ». Это также разновидность полупериодической культуры . В некоторых случаях все питательные вещества загружаются в биореактор. Преимущество периодической культуры с подпиткой состоит в том, что можно контролировать концентрацию подпитываемого субстрата в культуральной жидкости на произвольно желаемых уровнях (во многих случаях на низких уровнях).
Вообще говоря, периодическая культура с подпиткой превосходит обычную периодическую культуру, когда контроль концентрации питательного вещества (или питательных веществ) влияет на выход или продуктивность желаемого метаболита.
Типы биопроцессов, для которых эффективно культивирование с подпиткой, можно резюмировать следующим образом:
1. Подавление субстратом
Питательные вещества, такие как метанол, этанол, уксусная кислота и ароматические соединения, подавляют рост микроорганизмов даже при относительно низких концентрациях. При правильном добавлении таких субстратов время задержки может быть сокращено, а ингибирование роста клеток заметно снижено.
2. Высокая плотность клеток (Высокая концентрация клеток)
В периодической культуре для достижения очень высоких концентраций клеток, например 50-100 г сухих клеток / л, необходимы высокие исходные концентрации питательных веществ в среде. При таких высоких концентрациях питательные вещества становятся ингибирующими, даже если они не имеют такого эффекта при обычных концентрациях, используемых в периодических культурах.
3. Эффект глюкозы (Эффект Крэбтри )
При производстве пекарских дрожжей из солодового сусла или мелассы с начала 1900-х годов было признано, что этанол производится даже в присутствии достаточного количества растворенного кислорода (DO) если в культуральной жидкости присутствует избыток сахара. Этанол является основной причиной низкого выхода клеток. Аэробное образование этанола в присутствии концентрации глюкозы известно как эффект глюкозы или эффект Крэбтри. Чтобы уменьшить этот эффект, периодический процесс с подпиткой обычно используется для производства пекарских дрожжей. В аэробных культурах Escherichia coli и Bacillus subtilis органические кислоты, такие как уксусная кислота (и в меньших количествах, молочная кислота и муравьиная кислота), образуются в качестве побочных продуктов при высокой концентрации сахара, и они кислоты подавляют рост клеток, а также оказывают ухудшающее влияние на метаболическую активность. Образование этих кислот называется бактериальным эффектом Крэбтри.
Когда микроорганизм находится под воздействием h - это быстро метаболизируемый источник углеродной энергии, такой как глюкоза, результирующее увеличение внутриклеточной концентрации АТФ приводит к подавлению биосинтеза фермента (ов), тем самым вызывая более медленный метаболизм источника энергии. Это явление известно как катаболическая репрессия. Многие ферменты, особенно те, которые участвуют в катаболических путях, подвержены этой репрессивной регуляции. Мощный метод преодоления катаболитной репрессии в биосинтезе ферментов - это периодическая культура с подпиткой, в которой концентрация глюкозы в культуральной жидкости поддерживается на низком уровне, где рост ограничен, а биосинтез фермента снижается. Медленное введение глюкозы в ферментацию пенициллина с помощью Penicillium chrysogenum является классическим примером в этой категории.
5.
В микробном процессе, использующем ауксотрофный мутант (мутант, нуждающийся в питании), избыток необходимого питательного вещества приводит к обильному росту клеток с небольшим накоплением желаемого метаболита из-за ингибирования по обратной связи и / или репрессии конечного продукта. Однако недостаток необходимого питательного вещества снижает рост клеток, а также общую продукцию желаемого метаболита, поскольку скорость производства обычно пропорциональна концентрации клеток. В таком биопроцессе накопление желаемого метаболита можно максимизировать путем выращивания мутанта на ограниченном количестве необходимого питательного вещества. Чтобы культивировать мутант при низкой концентрации необходимого питательного вещества, его подают в периодическую культуру с контролируемой скоростью. Этот метод часто используется в промышленных производствах аминокислот с ауксотрофными мутантами. Примером является продуцирование лизина требующим гомосерин или треонин / метионин мутантом Corynebacterium glutamicum, в котором отсутствует ген гомосериндегидрогеназы.
6. Контроль экспрессии гена с репрессируемым промотором
Транскрипция гена, имеющего репрессируемый промотор перед открытой рамкой считывания, репрессируется за счет комбинации так называемого голорепрессора с операторной областью на ДНК. Когда определенное химическое соединение существует в культуральной жидкости, соединение (или его метаболит) в клетках объединяется в качестве ко-репрессора с апо-репрессором (своего рода транскрипционный фактор), образуя холо-репрессор. Сохранение концентрации этого соединения как можно более низкой (при одновременном обеспечении достаточного роста клеток) позволяет продолжать экспрессию регулируемого гена. Пакетная культура с подпиской - мощный инструмент для этого. Примерами репрессируемого промотора являются промотор trp и промотор phoA.
7. Увеличение времени работы, добавление воды, теряемой при испарении, и снижение вязкости культурального бульона
Стратегия с подпиткой обычно используется в биопромышленных процессах для достижения высокой плотности клеток в биореакторе. Обычно исходный раствор имеет высокую концентрацию, чтобы избежать разбавления биореактора. Производство гетерологичных белков с помощью периодических культур рекомбинантных микроорганизмов с подпиткой широко изучено.
Контролируемое добавление питательного вещества напрямую влияет на скорость роста культуры и помогает избежать метаболизма переполнения ( образование побочных метаболитов, таких как ацетат для Escherichia coli, молочная кислота в культурах клеток млекопитающих, этанол в Saccharomyces cerevisiae ), ограничение кислорода (анаэробиоз).
Простейшая периодическая культура с подпиткой - это та, в которой скорость подачи ограничивающего рост субстрата равна постоянная, т.е. скорость подачи неизменна во время культивирования. Этот случай показан на графике (здесь объем культуры переменный). Этот тип периодической культуры с подпиткой называется периодической культурой с постоянной подпиткой (CFBC) и хорошо известен математически и экспериментально. В CFBC были изучены оба случая CFBC с фиксированным объемом и CFBC с переменным объемом.
На графике показан принцип периодического культивирования с подпиткой, ограниченным субстратом, с начальной фазой загрузки. После потребления исходного субстрата начинается непрерывная и постоянная подача субстрата. В идеальных условиях клетки растут экспоненциально. Если скорость подачи ограничивающего рост субстрата увеличивается пропорционально экспоненциальной скорости роста клеток, можно поддерживать удельную скорость роста клеток в течение длительного времени, сохраняя при этом концентрацию субстрата в культуральной жидкости на постоянном уровне. уровень. Требуемая скорость подачи (объемная или массовая) должна увеличиваться экспоненциально со временем, так что этот режим периодического культивирования с подпиткой называется периодической культурой с экспоненциальной подпиткой (EFBC).
Ограничение субстрата дает возможность контролировать скорости реакции, чтобы избежать технологических ограничений, связанных с охлаждением реактора и переносом кислорода. Ограничение субстрата также позволяет контролировать метаболизм, избегать осмотических эффектов, репрессии катаболитов и избыточного метаболизма побочных продуктов.
Для контроля рост в периодическом процессе с подпиткой:
| Параметр управления | Принцип управления |
|---|---|
| DOT (pO 2) | DOstat (DOT = constant), F ~ DOT |
| Скорость поглощения кислорода (OUR) | OUR = константа, F ~ OUR |
| Глюкоза | измерение глюкозы в режиме онлайн (FIA), глюкоза = постоянное значение |
| Ацетат | измерение в режиме онлайн ацетат (FIA), ацетат = постоянный |
| pH (pHstat) | F ~ pH (подкисление связано с высоким содержанием глюкозы) |
| Аммиак | измерение аммиака в режиме онлайн (FIA), аммиак = константа |
| Температура | T адаптирована в соответствии с OUR или pO 2 |
