Войти
Дифракция электронов на микрокристаллах или MicroED - это метод CryoEM который был разработан лабораторией Gonen в конце 2013 года в исследовательском кампусе Janelia медицинского института Howard Hughes. MicroED - это форма электронной кристаллографии, в которой тонкие трехмерные кристаллы используются для определения структуры с помощью электронной дифракции.
Метод был разработан для определения структуры белков из нанокристаллы, которые обычно не подходят для дифракции рентгеновских лучей из-за своего размера. Кристаллы, размер которых составляет одну миллиардную от размера, необходимого для рентгеновской кристаллографии, могут давать данные высокого качества. Образцы заморожены и гидратированы, как и для всех других методов криоЭМ, но вместо использования просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ ) в режиме визуализации его используют в режиме дифракции с чрезвычайно низкая электронная экспозиция (обычно < 0.01 e/Å/s). The nano crystal is exposed to the diffracting beam and continuously rotated while diffraction is collected on a fast camera as a movie. MicroED data is then processed using traditional software for рентгеновская кристаллография без необходимости в специализированном программном обеспечении для анализа и уточнения структуры. Важно отметить, что как аппаратное, так и программное обеспечение, используемое в эксперименте MicroED, стандартно и широко доступно.
О первой успешной демонстрации MicroED сообщила в 2013 году лаборатория Gonen. Структура лизоцима, классического тестируемого белка в рентгеновской кристаллографии. Ранее в 2013 году группа Abrahams независимо представила данные 3D электронной дифракции с использованием квантового детектора площади Medipix на кристаллах лизоцима, но не смогла определить структуру из-за технических ограничения.
Подробные протоколы настройки электронного микроскопа и сбора данных были опубликованы.
Данные MicroED собирают с помощью просвечивающей электронной (криогенной) микроскопии. Микроскоп должен быть оборудован апертурой для выбранной области, чтобы использовать дифракцию в выбранной области.
Для сбора данных дифракции электронов в экспериментах MicroED использовались различные детекторы. Были использованы детекторы, использующие технологию устройства с зарядовой связью (CCD) и комплементарный металл-оксид-полупроводник (CMOS). С помощью КМОП-детекторов можно интерпретировать индивидуальные подсчеты электронов.
В первоначальной проверке концепции публикации MicroED использовались кристаллы лизоцима. С одного нанокристалла было собрано до 90 градусов данных с дискретными шагами между кадрами в 1 градус. Каждая дифракционная картина была получена при сверхнизкой мощности дозы ~ 0,01 э / Å / с. Данные от 3 кристаллов были объединены для получения структуры с разрешением 2,9 Å с хорошей статистикой уточнения и представляли первый случай, когда дифракция электронов была успешно использована для определения структуры дозозависимого белка из трехмерных микрокристаллов в криогенных условиях.
Вскоре после подтверждения принципа работы MicroED была улучшена путем применения непрерывного вращения во время схемы сбора данных. Здесь кристалл медленно вращается в одном направлении, а дифракция записывается на быструю камеру как фильм. Методология похожа на метод вращения в рентгеновской кристаллографии. Это привело к нескольким улучшениям качества данных и позволило обрабатывать данные с помощью стандартного программного обеспечения для рентгеновской кристаллографии. Преимущества непрерывного вращения MicroED включают уменьшение динамического рассеяния и улучшенную выборку обратного пространства. Непрерывное вращение является стандартным методом сбора данных MicroED с 2014 года.
Подробные протоколы обработки данных MicroED были опубликованы. Когда данные MicroED собираются с использованием непрерывного вращения столика, можно использовать стандартное программное обеспечение кристаллографии .
Другие методы дифракции электронов, которые были разработаны для материаловедения нечувствительных к излучению материалов, таких как неорганические соли, включают автоматизированную дифракционную томографию (ADT) и ротационную электронную дифракцию ( КРАСНЫЙ). Эти методы существенно отличаются от MicroED: в ADT используются дискретные шаги наклона гониометра для покрытия обратного пространства в сочетании с прецессией луча для заполнения промежутков. ADT использует специализированное оборудование для прецессионной и сканирующей просвечивающей электронной микроскопии для отслеживания кристаллов. КРАСНЫЙ цвет выполняется в ПЭМ, но гониометр наклоняется дискретно, и наклон луча используется для заполнения промежутков. Для обработки данных ADT и RED используется специализированное программное обеспечение. Важно отметить, что ADT и RED были разработаны и испытаны на нечувствительных к радиации неорганических материалах и солях и не были продемонстрированы для использования с белками или чувствительными к излучению органическими материалами, изученными в замороженном гидратированном состоянии.
MicroED использовался для определения структур крупных глобулярных белков, малых белков, пептидов, мембранных белков, органических молекул и неорганических соединений. Во многих из этих примеров наблюдались водороды и заряженные ионы.
Первые новые структуры, решенные с помощью MicroED, были опубликованы в конце 2015 года. Эти структуры были пептидные фрагменты, которые образуют токсичное ядро α-синкулеина, белка, ответственного за болезнь Паркинсона, и позволяют понять механизм агрегации токсичных агрегатов. Структуры расшифрованы с разрешением 1,4 Å.
Первая новая структура белка, решенная с помощью MicroED, была опубликована в 2019 году. Этот белок представляет собой металлоферментную R2-подобную лиганд-связывающую оксидазу (R2lox) из Sulfolobus acidocaldarius. Структура была расшифрована с разрешением 3,0 Å путем молекулярной замены с использованием модели 35% идентичности последовательностей, построенной на основе ближайшего гомолога с известной структурой. Эта работа продемонстрировала, что MicroED можно использовать для получения неизвестной структуры белка.
Чтобы узнать больше о MicroED, можно посетить ежегодный курс MicroED Imaging Center в UCLA или курс MicroED в Алмазный источник света. Для получения более свежей информации о предстоящих встречах и семинарах, связанных с методами криогенной электронной микроскопии в целом, посетите страницу встреч и семинаров 3DEM.
. Некоторые университеты и компании предлагают услуги MicroED, в том числе MEDIC - Центр микрокристаллической электронной дифракции в UCLA и Nanoimaging Services.
